乳牛之繁殖障礙與泌乳障礙

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林達雄    譯

        6.性週期 ( 發情周期 )

        (1)性週期的長度

        達到性週期的雌牛，按一定的週期反覆發情及排卵。此週期平均 20 ~ 21 日，個體間有差異。大的牛群其性週期的 60 ~ 80% 在 17 ~ 25 日的範圍內。未經產牛的性週期有比經產牛短的傾向，其平均值為 20 日，比經產牛的 21 日短了 1 日。性週期的長度亦受到環境的影響，在低營養條件或嚴酷的氣候條件下發情或排卵受到抑制而性週期延長。

        (2)性週期之區分

        性週期大別分為發情前期 ( proestrus )，發情期 ( estrus )，發情後期 ( metestrus ) 及發情休止期 ( diestrus ) 之 4 期，但很難區分得清楚。一般而言，發情前期是由發情休止期移行至發情期的 2 ~ 3 日的時期，在卵巢內卵胞開始發育。發情期是發情，亦即容許雄牛交配的時期，約持續 20 小時。發情後期是連接發情直後的時期，概略而言是受精卵移動至子宮前的 3 ~ 4 日的時期。發情休止期是過了發情後期而至發情前期的期間，在此時期黃體充分發育，並分泌黃體荷爾蒙。

        (3)性週期中卵巢的變化

        在性週期中卵巢呈現如下的變化。卵胞發育的初期卵胞是緩慢發育，但至發情開始時卵胞的發育速度急速增加。至快成熟時卵胞即突出於卵巢表面，成熟的卵胞直徑達 1.6 ~ 1.9 cm。排卵數通常是 1 個。排卵直後卵胞腔縮小，變成直徑 0.6 ~ 0.7 cm，內腔充滿顆粒膜細胞及卵胞膜內層細胞的曲折層。通常不大看得到疑血，但卵巢表面之排卵點則有若干之出血。之後，卵胞內部有由顆粒膜細胞及卵胞膜內層細胞所形成的黃體組織增殖，從而有黃體形成。

        黃體於性週期的 7 ~ 8 日即已完成，直徑達 2.0 cm 或超過。所形成的黃體有一部分突出於卵巢表面而產生小豆大的突起。此種突起經由直腸檢查可明顯的觸知。此後，至性週期的 12 ~ 15 日內呈最盛期的活動，以後即退行，但其機能持續至 17 ~ 19 日。黃體由於細胞中含有黃色顆粒狀的色素故帶黃色，但其色調視黃體形成後的時期而變化。初期呈赤褐色，至最盛期變為橙色 ( 橘色 )，進入退行期時黃色增強而變為黃橙色，最後變為深紅色或赤褐色。似此，發情黃體退縮而變成深紅色或赤褐色者稱為紅體。紅體在 2 ~ 3 週期時可由肉眼看出來，但此後只剩下組織學上之痕跡而已。

        (4)性週期中子宮的變化

        a.組織：子宮內膜上有多數的子宮膜存在。子宮內膜之厚度及子宮腺的形態是受到卵巢由來之固醇類荷爾蒙 ( steroid  hormone ) 的影響，隨性週期的時期而變化。

        在發情期由於卵胞所分泌之女性荷爾蒙的作用內膜之脈管的分佈增加，子宮內膜上皮形成低圓柱狀。且子宮腺亦有幾分發育，但呈直線的形狀。

        排卵後及黃體期由於黃體所分泌之黃體荷爾蒙的作用而子宮內膜增厚，子宮內膜上皮亦增高，並於性週期中達到最高。子宮腺的發育亦在性週期中達到最大，其構造呈捲線 ( coil ) 狀，很複雜的纏繞在一起。

        至黃體末期肥厚的子宮內膜厚度減少，子宮腺亦縮小。

        b.子宮運動：子宮在發情期或黃體期均行自律性的收縮運動。此種運動受到女性荷爾蒙、黃體荷爾蒙的作用而變化，據測定的結果，子宮的收縮運動在發情期為最大，發情後 2 ~ 3 日運動性減少，至黃體期其收縮運動變成低調。

        另外，發情期的子宮，除了此種自律的運動之外，對外部的機械性刺激或性的刺激呈現敏感反應，並強烈收縮。

        c.子宮分泌液：子宮腺雖會分泌子宮液，但其液量不若頸管或陰道所分泌的黏液量多。分泌液的量或性狀隨性週期的時期而變化。發情期的子宮液呈水樣，約有 2 ml 左右 ( 0.28 ~ 5.10 ml )。發情後的子宮液混有血液而呈黏稠樣，容易凝固，液量急激減少。至性週期的 4 ~ 10 日則形成稍帶黃色的液體，而至性週期的 11 ~ 13 日液量稍增加而黏稠性增高。此種分泌液的量或性狀的變化均由於卵巢而來的固醇類荷爾蒙，即女性荷爾蒙及黃體荷爾蒙的作用。

        (5)性週期中子宮頸管黏液的變化

        a.黏稠度及分泌量：非發情期的子宮頸管充塞以濃度而黏稠的黏液，但發情的 1 ~ 2 日前開始軟化，至發情期則有富於牽縷性的大量黏液流出。

        b.結晶形成現象：將頸管黏液塗抹於軟玻片上並使之乾燥時，發情期的黏液會出現羊齒狀的結晶像。此種結晶形成現象與發情期之頸管黏液中所增加的氯化鈉濃度有密切的關係，而非發情期的黏液則由於氯化鈉濃度低，故無結晶形成現象。

        c.精子受容性：頸管黏液之精子受容性在發情期增高。其原因是發情期中黏液的蛋白質 ( mucin ) 發生構造變化，分子間產生間隙，致精子容易運動，而且，發情期之頸管黏液中所增加的鹽類濃度亦對黏液的精子受容性有貢獻。

        d.電氣傳導度：頸管黏液中的鹽類濃度隨性週期的時期而變化，結果，黏液的電氣傳導度亦隨性週期的時期而變化。即在非發情期電氣傳導度低，但從發情的 2 ~ 3 日前呈現上昇傾向，至發情之日達到最高。

        e. pH：頸管黏液的 pH 隨性週期的時期而變化，在發情期為最低。即非發情期的平均值為 6.8 ~ 7.4，但發情期則平均值低至 6.5。

        7.發     情

        (1)發情徵候

        雌牛發情時，舉動發生變化，容許雄牛的交配。且外陰部亦有變化，卵巢、子宮、陰道亦有內部變化。

        a.舉動的變化：發情牛在初期對聲響敏感，轉動耳朵而時常注意外界的聲響。眼光銳利，以高昂的特有的鳴聲咆哮，舉動不安靜，在牛舍內團團轉。群飼雌牛的場合則離群而行動，或乘駕其他雌牛。在乘駕之前先以鼻嗅其他雌牛的外陰部，或以顎磨擦腰的部分。至發情的極期即使被雄牛或其他雌牛乘駕亦靜止不動。有些雌牛會少量而頻回排尿，或食慾減退，乳量減少，惟個體間差異很大。此種舉動的變化乳牛比肉牛顯著。

        b.外陰部之充血，弛緩及腫脹：黃體期的外陰部堅硬緊縮，陰唇的表面有數條皺紋，但發情時外陰部弛緩、腫脹、陰唇的皺紋消失。以手指弓開陰唇時可見到陰道黏膜濕潤潮紅充血。

        c.黏液之排出：發情期主由子宮頸管，一部分由子宮或陰道排出多量的分泌液。結果，外陰部有透明的黏液下垂，或附著於臀部、尾巴、或掉落於牛舍的床面或地面。發情期間中所分泌的黏液量約達 100 ml ( 27 ~ 230 ml )，但發情期間中不常流下而貯留在陰道內，在起臥之際或乘駕他牛時流下者頗多。

        黏液在發情初期為透明、牽縷性強、黏液量多。至發情中期黏液稍呈半透明、黏液量亦減少、黏著性增加。至發情末期，黏液量變得極少、黏著性增強、呈半透明。發情最盛期的黏液置於載玻片上乾燥時出現特有的羊齒狀結晶像，精子受容性增高。

        d.卵巢及子宮的變化：經由直腸而觸診卵巢時，在卵巢表面可觸知直徑 1.0 cm 以上之發育卵胞，由其緊張度或波動感可判別出發情的經過。另外，子宮呈現緊張，對觸診的刺激呈現反應而持續性收縮。

        (2)發情開始的時刻

        一般而言，不論晝夜都會開始發情，發情開始的頻度並不因時刻而異。惟有的報告認為發情開始時刻的頻度有若干之日內變動，發情的 54.8%係於晝間開始，其高峰在上午 6 時左右。

        (3)發情持續時間

        由發情開始至終了稱為發情持續時間，牛的發情持續時間平均 17 小時左右 ( 2.5 ~ 30.0 小時 )，經產牛與未經產牛相比發情持續時間稍微長一點。

        對發情牛從外部加以性的刺激能影響發情持續時間，並使之縮短。

        (4)發情後之出血

        牛在發情後往往見到混有血液的黏液流出於外陰部，並附著於尾或後乳房的四周。此係因發情後之荷爾蒙變化，致子宮之毛細血管破裂，所滲出的血液混在黏液中而由外陰部排出者。有此種出血的牛，未經產牛達 80 ~ 90%，經產牛達 45 ~ 65%，見到出血的時期是在發情終了後平均 35 ~ 45 小時。據 Weber 等 ( 1948 ) 的報告，即使肉眼看不到出現，但行顯微鏡檢查時所有的未經產牛均可見到出血。

        牛看到此種出血時，即使忽略過發情的場合亦可知 2 ~ 3 日前出現發情，此對次回發情日的推測有幫助。

        (5)發情發現法

        雌牛與雄牛在自然狀態下放牧的場合，發情雌牛會自然接近雄牛，在交配適期會容許雄牛的乘駕。但雌牛與雄牛個別飼養的場合，就必須正確把握配種適期進行授精。尤其在最近之多頭化及省力管理的飼養形態下，發情發現便成為提高繁殖率的重要課題。

        發情發現通常是靠觀察發情徵候。即一日之中於一定時刻觀察牛隻舉動以發現出發情。牛群放牧時，由乘駕及被乘駕等行動變化可發現出發情，但此種行動變化乳牛方面比肉牛容易發現出來。即乳牛方面若牛群中有發情牛存在時很容易乘駕他牛，但肉牛方面即使牛群中有發情牛存在，採取乘駕行動的牛亦很少。

        發情發現法，除了此種靠發情徵候的觀察方法外，尚有將裝有墨水的盒子綁在輸精管結紮雄牛的顎下，然後將此種雄牛放入雌牛群中，則乘駕時雌牛的背部會沾上墨水，由此發現出發情雌牛 ( 墨水盒法 )。另外，亦有將內臟有裝入色素液之膠囊的布片纏在雌牛的腰部，當發情而乘駕其他雌牛時膠囊破裂而布片染上顏色，由此亦可發現出發情雌牛 ( 腰布法 )。

        最近，蘇俄及歐洲國家亦開發出一種測定子宮頸管黏液之電氣抵抗值的發情檢定器，惟使用尚不普遍各種方法之牛的發情發現率如表 3 所示。

表 3     各種方法之牛的發情發現率 ( 杉江，1980 )

        8.排     卵

        (1)排卵之時期

        排卵是發生於發情開始後平均 25 ~ 30 小時，但早者在發情開始後 16 小時，遲者在 65 小時後排卵。另外，由發情終了後的時間來看，則平均在 11 ~ 13 小時後排卵，早者固然有在發情終了前排卵者，但大部份是在發情終了後排卵，在終了前排卵者很少。遲者亦有在終了後 34 小時才排卵。家畜之中只有牛係在發育終了後排卵，其他馬、豬等均在發情中排卵。

        由發情開始或發情終了後至排卵的時間，是隨著年齡的增加而延長。發情期的交配刺激或黃體荷爾蒙的注射有促進排卵的效果，而且，在發情開始時注射 Atropin 會使排卵延遲。

        (2)左右卵巢之排卵頻度

        乳牛每一次發情通常排卵一個，一般人認為是左右卵巢交互排卵 ( 即各為 50% )。但 Reece 等調查實際排卵之頻度，發現右卵巢有 57 ~ 58%，左卵巢有 42 ~ 44% 之排卵頻度，即右卵巢之排卵頻度比較高。其理由可能是因第一胃在左腹部，致受到壓迫而左卵巢的活動受到抑制。

        (3)多排卵

        乳牛有時候在 1 發情中排卵 2 個或 2 個以上。此種多排卵的頻度為 13 ~ 15%。

        (4)排卵之機構

        排卵是由於發情時腦下垂體大量分泌的黃體形成荷爾蒙 ( LH ) 所誘起。腦下垂體之 LH 的大量分泌通常稱為 LH  surge。LH 之作用後卵胞所引起的變化，以往認為是隨著卵胞的急速發育而增加的卵胞液使得卵胞內壓增大，結果卵胞表面破裂而引起排卵。惟經測定卵胞發育時內壓之變化的結果，發現內壓並不隨卵胞發育而增加，在排卵前反而是低下。直腸檢查之觸診亦顯示排卵前之卵胞彈性增加而有柔軟之感觸。

        卵胞內所引起的化學變化，乃是 prostaglandin 或 collagenase 樣酵素增加，且 collagen ( 膠原質 ) 的分解產物亦增加，plasmin 也增加。基於這些事實，現在認為排卵的機構如下。即由於 LH 的作用而使得卵胞內之黃體荷爾蒙分泌變得旺盛，結果 prostaglandin 的分泌亦增加。這些黃體荷爾蒙及 prostaglandin 與作用於卵胞壁的 collagenase ( 膠原質酵素 ) 的作用有關係，且經由此酵素作用而卵胞壁粗糙化、彈性增加。另一方面，卵胞液的貯留增加，引起卵胞壁之溢血或血流停止，stigma 亦形成。從而引起卵胞壁之平滑肌的局部收縮，發生排卵。

        9.授     精

        (1)授精部位與授精方法

        自然交配的場合射精部位是在陰道的深部，但人工授精的場合由於陰道內注入之受胎率很低，故現在已不採用，都行子宮頸管或子宮內注入。其中，子宮內注入的方法器具的前端可能會損傷子宮黏膜，或將細菌等直接帶入子宮內，故今日最理想的方法是將精液注入子宮頸管之中央部稍前方，即注入頸管之深部的子宮頸管深部注入法。注入方法有直腸陰道法 ( 子宮頸把握固定法 ) 及頸管鉗子法 ( 子宮頸鉗子固定法 )，而最近多採用直腸陰道法。精液的注入量以 0.5 ~ 1.0 ml，注入精子數以 2,500 ~ 5,000 萬為基準。

        (2)精子在雌生殖道內之進行

        被授精的精子通過雌生殖道內而到達受精部位的輸卵管膨大部的時間相當快，一部分在數分鐘左右即到達，此後數目徐徐增加，在數小時後多數的精子均到達。雌生殖道內精子的進行，除了精子本身之運動性外，含抬子宮之吸引作用在內的雌生殖道的收縮運動亦具有重要的作用。

        (3)精子之受精能保持時間

        在雌生殖道內精子之受精能力保持時間受到精液之條件或授精部位，雌生殖器內之環境等的影響，但通常在 30 ~ 48 小時。

        惟此乃是精子可能受精的時間，受胎率則隨著時間的經過而降低。因此，被授精的精子在受精能獲得後應盡快遭遇卵子而受精。另外，老化精子的受精會招致胚胎的早期死滅。

        (4)卵子之受精能保持時間

        排卵後之卵子的受精能保持時間，受到雌牛之生殖道內的環境的影響，但一般認為是 8 ~ 12 小時。因此，卵子之受精能保持時間比精子短得多。

        另外，排卵後的卵子，即使在受精能保持時間內，亦隨著時間的經過而受精率或受精後的胚死滅率發生變化，在排卵後 2 ~ 4 小時內授精的場合受精率高，胚的早期死滅少，但排卵後授精時間延遲者受精率降低，胚的早期死滅率急速增高。

        (5)精子之受精能獲得

        精子在雌生殖道內必須先受到一定時間的變化以獲得受精上之必要能力，此現象稱為精子的受精能獲得 ( capacitation )。有關牛精子之受精能獲得現象的有無長久以來不大清楚，但 Trimberger 等 ( 1948 ) 發現排卵前 6 小時以後授精者的受胎率低，推測有受精能獲得現象之存在。最近，由體外授精之實驗結果，亦確認牛方面有受精能獲得現象之存在 ( Iritani 等 1977 )。據報告，當精子沿發情牛之子宮及輸卵管上走的場合，可能在 3 ~ 4 小時內獲得受精能。

        (6)授精適期

        排卵後之卵子的受精能保持時間比較短，且隨著時間的經過而受胎率低下，故排卵後必須儘快與精子遭遇而受精。另一方面，精子與卵子遭遇前須經過一段時間以獲得受精能，因此，為了提高受胎率必須適期進行授精。

        Trimberger 等 ( 1948 ) 調查發情期間中及發情終了後各時期授精的場合的受胎率，發現為了得到高受胎率必須在發情開始後 6 小時以後至發情終了後 6 小時這段期間內進行授精 ( Salisbury  等 1978 )。惟雌牛之發情徵候的出現個體間有差異，正確的發情開始時刻很難把握，且發情的持續時間亦不一定，故實用上於早晨發現發情的場合於當日下午；於上午發現發情的場合於當日之傍晚或翌日於下午發現發情的場合則於翌日的上午進行授精。

        10.妊     娠

        (1)妊娠期間

        乳牛之妊娠期間在 280 日左右。各品種之平均妊娠期間如表 4 所示。除了品種之外胎兒的性別對妊娠期間亦有影響，雄胎兒的妊娠期間比雌胎兒長 1 ~ 2 日。分娩的季節亦會引起變化，於冬季或春季所生的子牛妊娠期間有稍延長的傾向。妊娠期間之遺傳率為 0.22 ~ 0.50，受到某程度之遺傳的影響。

表 4     乳牛各品種之妊娠期間 ( Hafez 等，1974 )

        (2)妊娠之過程

        由卵之受精至分娩的妊娠期間大體分為 3 期。即第 1 期是由受精卵的時期至受精後 12 日，第 2 期是胚的時期，大致由受精後 13 日至 45 日，第 3 期為胎兒的時期，大致是 46 日以後至出生的期間。

        a.第 1 期 ( 受精卵及早期胚期 )：在輸卵管膨大部受精的卵子一方面繼續分裂，一方面徐徐至輸卵管。受精卵最初是 1 細胞卵，於 1 ~ 1.5 日後變成 2 細胞卵。2 細胞卵之後即稱為胚，但 2.5 日後變為 8 細胞卵，4 日後變為 16 細胞卵並進入子宮內。至 8 ~ 9 日形成胚盤胞 ( blastocyst )。胚盤胞在 12 日內大致為 1.5 mm。

        b.第 2 期 ( 胚芽期 )：第 2 期是器官之原基形成的時期。即消化管、肺、肝臟、胰臟等主要臟器的原基形成，神經組織產生。循環器系亦開始出現。妊娠的 21 ~ 22 日心臟的搏動開始。

        著床過程是在緩慢進行，故著床的開始時期很難限定，但大致是 30 ~ 40 日。至 45 日時足及尾已能清楚分辦出來，胚大體長 3.3 cm，重 2.5 g。當著床完了，絨毛膜完全接著於子宮內膜而胚血管形成時，營養的供給即依賴母血，但在此之前受精卵及胚的營養則靠卵本身之卵黃顆粒及子宮乳 ( uterine  milk ) 所供給。子宮乳為黃色或白色之濃厚不透明的子宮腺的分泌物。

        c.第 3 期 ( 胎兒期 )：第 3 期之胎兒 ( 胎子 ) 期發生胎兒的發育及成熟。胎兒被絨毛膜、尿膜、羊膜所成的胎膜所包裝，並漂浮在羊水中。胎兒的發育是比較緩慢的速度進行，但妊娠最後的 2 ~ 3 個月則體重急速增加，分娩時之子宮重量 ( 包括內容物 ) 大致為 68 kg，但胎兒則佔其中的 60%，剩下的 25%為羊水及尿水，5%為胎膜，10%是子宮本身的重量。

        胎兒之體長或體重可用於推定胎兒的月齡或做為成長率之基準。體長之測定部位是由頭頂至臀部的長度 ( Crown  rump  length )。妊娠月齡之體長及體重的平均值如表 5 所示。另外，隨著胎兒的發育所帶來之妊娠各時期的變化如表 6 所示。

表 5     牛之妊娠各時期胎兒的體長及體重 ( Roberts  1971 )

表 6    牛之妊娠各時期胎兒的變化 ( Roberts , 1971 )

        (3)妊娠診斷法

        授精後如能儘快得知此牛是否已經受胎的話，則受胎的場合可建立流產之預防或此後之管理計劃，不受胎的場合則能究明其原因而採取對策，故早期妊娠診斷對繁殖率之提高非常重要。

        妊娠診斷由其目的來看，必須適中率高，手法簡單，診斷所要的時間短，所需的經費亦少，對母體及胎兒全然沒有不良影響，且診斷的時期要在授精後儘早。實際的妊娠診斷是以妊娠所引起的母體的變化或胎兒及其附屬物的存在為指標。現在已知的妊娠診斷法有下列幾種。

        a.無回歸 ( Nonreturn ) 法 ( NR 法 )：妊娠時通常不再有發情回歸現象，故可以授精後之發情回歸為指標而行妊娠診斷。此乃是調查授精後一定期間的發情回歸情形，如無發情時即判定為妊娠，此有 60 日無回歸，90 日無回歸等表示法。此種方法係由日常之發情的觀察結果來判定，故簡便易行。但亦有妊娠而仍然呈現發情，或即使不妊娠亦不呈現發情者，故適中率並不怎麼高。

        b.直腸檢查方法：妊娠的早期，可經由直腸檢查以觸診出因妊娠而產生的胎盤，加以診斷。妊娠日齡大者，可由子宮之大小或中子宮動脈之震動、胎盤之觸知等來診斷。

        即妊娠初期的場合，妊娠胎兒是位於子宮角的中央，但由於胎膜發育，兩端細長發達，故可經由直腸檢查觸知胎膜而行診斷。在檢查時，最初可確認出黃體的存在，然後以姆指及食指探索黃體對側之子宮角的體部的鄰近部位，若妊娠的場合即可得知胎膜獨特的感觸。黃體同側之子宮角亦能診斷出來，但此時要注意胎兒的位置是在觸診部位的附近。以此種方法行診斷者通常在妊娠 40 日以後，但熟練的人在 33 ~ 34 日左右即能診斷出來。以本法行診斷的適中率非常高，技術熟練者可達到 100%。

        另外，妊娠日數接近 60 日時，子宮角由於胎液的存在而呈現波動感，妊娠 60 日以後中子宮動脈發達血管因血流而震動，65 日以後更可觸知胎盤，這些均可做為指標而行妊娠診斷。

        c.觀察子宮頸管黏液的方法：子宮頸管黏液在妊娠時形成黏液栓而變為黏著性強的糊狀物，故可應用此種性狀的變化而行妊娠診斷。其方法有採取頸管深部之黏液以調查其黏著度的方法，或在 2 枚載玻片中間挾以中量的黏液，經 3 ~ 4 回回轉後由出現的黏液像來判定的方法。前者的方法在配種後 15 ~ 60 日實施，據報告可得到 97%之高度適中率，後者在交配後 35 ~ 40 日以後實施，其適中率據說超過 95%。本法中頸管黏液的性狀的變化是由於黃體荷爾蒙的作用而引起。但頸管黏液會受到子宮分泌液的影響，故當卵巢或子宮有異常的場合即會成為誤診的原因。

        d.女性荷爾蒙注射的方法：於授精後次回發情預定日的 2 ~ 3 日前注射女性荷爾蒙 ( estrogen ) 或女性荷爾蒙物質，以此後發情誘發的有無行妊娠診斷。即妊娠牛由於妊娠黃體存在，且血中黃體荷爾蒙值很高，故即使注射女性荷爾蒙亦不會出現發情徵候，但發情週期中的牛在發情預定日的 2 ~ 3 日前黃體退行，由於所注射女性荷爾蒙的作用而誘發起發情。

        注射的時期以發情閉止後 17 ~ 20 日為適當。若注射後 1 ~ 5 日內不出現發情徵候的場合即判定是妊娠。本法的場合，永久黃體會成為誤診的原因。

        e.血中或牛乳中之黃體荷爾蒙測定的方法：近年來荷爾蒙測定方法有很顯著的進步，從而開發出以血中或乳汁中之黃體荷爾蒙濃度為指標的妊娠診斷法。當授精後未妊娠的場合，發育的黃體機能未喪失而繼續分泌黃體荷爾蒙，故血中或牛乳中的黃體荷爾蒙濃度保持很高的值，應用此現象可以診斷出妊娠與否。即於授精後 20 日左右 ( 17 ~ 21 日 ) 黃體荷爾蒙濃度差異最大的時期採取血液或牛乳樣本，測定荷爾蒙濃度，由其結果判定妊娠與否 ( Robertson 等， 1971 )。據報告，此種方法的診斷適中率高達 80%以上。本法在荷爾蒙測定上須要若干之技術，但多數檢體的處理比較容易，診斷的時期亦早，故歐洲、美國等多在採用。本法之缺點是永久黃體等會增高黃體荷爾蒙值的疾病會引起誤診。

        (4)變異雌 ( freemartin )

        與雄形成雙子或雌雄異性多胎所生下的雌牛 90%以上形成不妊症，此種不妊牛稱為變異雌 ( freemartin )。此種雌牛卵巢通常不發達，小而未分化，成長後乳房亦小，外觀與去勢牛相似。變異雌乃是牛多發的現象，其他家畜很少發生。

        牛多胎的場合，在發生初期包圍胎兒的胎膜多互相融合，由於血管吻合的關係胎兒間多行血液交換。由此看來，變異雌的原因乃是由於雌雄胎兒間之體液或細胞的交換。變異雌的成因有種種說法，其中之一是荷爾蒙說，此學說認為雄的睪丸的發達比雌的卵巢的發達來得早，故雄的所分泌的化學物質，例如雄性荷爾蒙 ( androgen ) 經由胎盤的血管吻合而到達雌性胎兒身上，使胎兒的性腺及生殖道的發達受到抑制 ( Lillie , 1917 )。惟由於外因性之雄性荷爾蒙投與並不能作出變異雌，故此種學說現在已受到懷疑。另外一種是細胞說，此種學說認為由於血管吻合而使得雌雄雙方的細胞混在一起，互相具有對方的細胞而變為不正常 ( 形成 Chimera )，從而，雌的卵巢內有雄的 XY — 性細胞混入，此乃成為變異雌發生的原因。惟實際上金絲猿通常為雙子，雖然是細胞 chimera，但雌雄雙方的胎兒的生殖腺並無任何異常，此種事實亦使得此種學說站不住腳。

        最近受人重視者有性誘導物質說。此學說認為性誘導物質 ( medullarin ) 由雄胎兒移行至雌胎兒，結果，卵巢的發生受到阻礙而朝向睪丸化的方向 ( Short , 1969 )。

現代畜殖第十六卷 ( 70年 7 ~ 12月 )、70年10月號 ( 24 ~ 32 )