豬大腸菌毒素菌苗(Ecotosin)

台灣家畜生物化學製藥廠提供

壹、緒言

        病原性大腸桿菌 ( Enteropathogenic  Escherichia  coli ) 的感染為引起仔豬下痢原因之一已為不爭的事實 ( 2、5、7 )。

        大腸桿菌使仔豬致病的機轉，其一為此菌定能產生並分泌腸毒素 ( Enterotoxin )，引起類似人的霍亂般的嚴重下痢現象 ( 1、3、4 )，其二則是此菌具有侵人並傷害腸道粘膜組織之能力而造成嚴重腸炎 (6)，腸毒素有耐熱性 ( Heat  stable , ST ) 和非耐熱性 ( Heat  labile , LT ) 等兩類 ( 1、2、8 )，後者為具有抗原性的蛋白質，因此可以免疫注射使注射的動物產生抗體以中和腸毒素而免除疾病的發生。因此，要仔豬免於大腸桿菌感染後所引起的下痢，則仔豬體內必須同時兼有抗細菌體抗抗原之抗體和有抗腸毒素之免疫抗體。鑑於新生仔豬有免疫系統的缺陷，不能於出生數日即具免疫能力，故其免疫力的獲得，皆來自吸取高濃度單位的抗體之母豬初乳。

        本公司多年來致力發展一種同時具有對抗致病性大腸菌引起下痢兩種不同機轉的混合疫苗，即仔豬白痢疫苗，並以此疫苗進行實驗動物接種及田間應用試驗。經多次的改進及探討，確認本疫苗對母豬具有高度的安全性且能提引出高單位濃度之抗體，對新生仔豬的大腸菌感染下痢症具有預防效果。

        本報告為以本公司製備之仔豬白痢疫苗所進行之實驗兩年來累積所得之研究成績的報告。

貳、試驗材料與方法

        1.菌株：本疫苗所用菌株由全省多所養豬場得病仔豬糞便中分離所得。所有菌株以 Trypticase  soy  agar ( Difco ) 作繼代培養及保存。其中有些菌株以免腸結紮試驗 (5)及老鼠腎上腺細胞 ( Y–1 ) 試驗 (9) 而知具有產腸毒素能力。

        2.腸毒素之製備：將產毒菌株接種在 Trypticase  soy  broth ( Difco )，經 48 小時 37℃溫度下培養後，以離心方法除去菌體，其上清液用陰離子交換纖維處理後獲得含高濃度腸毒素之溶液。此溶液置於負 20℃溫度保存以供疫苗調配之用。

        3.疫苗之製備：個別培養後的各不同菌株，以高速離心法收集菌體，以一定單位濃度的腸毒素溶液相混合後，添加 0.2%福馬林溶液放置於 4℃冷藏庫靜置之。經一個月以上時間的處理後，菌液再以磷酸緩衝溶液 ( 0.005 MPBS，pH 7.0 ) 調整菌液濃度為每毫升 10⁸ 個細胞數時，即為疫苗製品。除疫苗作為基礎免疫用時混合鋁膠當輔劑外，補強用疫苗皆為不含鋁膠之含腸毒疫苗。

        4.疫苗保存試驗：本疫苗分別保存於 4℃及室溫 ( 25 ~ 30℃ ) 之中，然後分別在每個月取樣並進行檢定其效力，觀察其保存性，以 5 隻平均體重 2.5 公斤之健康白兔，接種疫苗 2 毫升在肌肉側肌肉經兩週，由耳動脈採血並測定血液中抗體力價。

        5.動物試驗：由兔商買進後在本公司飼養的白兔進行試驗。以 12 週齡左右之白兔分成六組，每組動物隻數均為 12 隻。第一組、第二組和第五組的動物用做疫苗免疫組，而其他的第三組、第四組和第六組則為前三組之對照組，對照組的各組動物則以磷酸緩衝溶液代替疫苗接種。

        以等量的疫苗和鋁膠輔劑混合而成之溶液，用每隻白兔 2 毫升的量，以肌肉注射給予免疫組作基礎免疫注射。兩週後，免疫組動物再以肌肉注射方法每週注射疫苗 2 毫升，連續兩週。

        6.活菌攻擊試驗：各組動物經兩次補強注射後的第七天進行本試驗。經 24 小時培養的大腸菌菌液，以遠心分離法收集菌體，然後用原培養液為稀釋液稀釋收集的菌體成為特定濃度的菌液 ( 如表 1、2 )，然後以口服方式和腸結紮試驗做菌攻擊試驗。以口服活菌攻擊者觀察動物一週內有無下痢發生。而以腸結紮試驗者，則在活菌攻擊後 18 小時觀察腸中內容物量的增加和發炎現象。在腸結紮試驗，活菌的每一懸浮液皆注入每隻動物的不連續之三段，每段長度為五公分的結紮腸子內以進行試驗。

表 1：口服活菌攻擊試驗之結果

表 2：腸結紮之活菌攻擊試驗結果

        7.田間試驗：本試驗在台南縣和高雄縣地區的八處養豬場進行。

        除表 3 所列之 No. 1 養豬場的母豬都曾由該場獸醫師以口服和注射接種其自家泡製之大腸菌液外，其他養豬場，其新生仔豬均受到病原性大腸菌感染有下痢之記錄者。

表 3：本疫苗接種前後母豬之抗體力價

        試驗組所有母豬皆於產前五週左右接種疫苗一次，再於產前兩週作補強疫苗接種。接種方式，皆在母豬左右耳後皮下輪番接種五毫升疫苗。於每次接種疫苗兩週內由接種獸醫師負責抽取母豬血液分離其血清，並以動物血球凝集反應及中和試驗測定血中抗細菌體抗原之抗體和抗腸毒素抗體力價。

        8.被動紅血球凝集反應 ( Passive  hemagglutination  test , PHA ) 試驗：本試驗為測定血液中抗血菌抗原之抗體力價者。

        大腸菌抗原是以經 24 小時培養之細菌，離心後用磷酸緩衝液精洗兩次，其懸浮液置於 100℃之水槽中 2 小時。離心後取其菌體並以 0.2%，福馬林處理，即成所要之抗原。

        致敏性紅血球則由 0.2 毫升新鮮綿羊紅血球用 20 毫升 0.85%鹽水清洗兩次，並作成 2.5%懸浮液，在加入等體積之 0.005%鞣酸混合後，置於 37℃下 10 分鐘。然後以磷酸緩衝液清洗一次作成 5%懸浮液。

        在 37℃下，等體積之紅血球和細菌抗原充分攪拌 2 小時，即成致敏性紅血球。

        被動紅血球凝集反應是在 V 字型底盤 ( V  shape  microtiter  plate ) 中進行。將血清以 2 倍連續系列稀釋法稀釋後，加入等量之致敏性紅血球懸浮液，靜置 2 小時後觀察盤底之血球凝集反應。抗體力價則為陽性反應之血清最高稀釋倍之倒數。

        9.中和試驗：本試驗為測定抗毒素抗體力價之反應者。將 2 倍連續系列稀釋之血清與已知抗原力價之腸毒素混合後放入此混合液於老鼠腎上腺細胞株培養上，並於 18 小時內觀察抑制細胞毒性反應現象。抗毒素抗體力價為能抑制細胞毒性反應之血清最高稀釋倍之倒數。

        10.毒性試驗：檢定疫苗之安全性時，以小白鼠和懷孕兩週之母豬分別進行之。以每週 0.5 毫升之劑量以皮下和腹腔注射方式各接種小白鼠 10 隻。而懷孕母豬 10 隻則每隻給予 5 毫升之劑量，在耳後做皮下接種。然後逐日觀察小白鼠之體重增減健康情形，母豬則觀察其食慾、體溫或流產有否之情況等等之反應，同時也觀察接種疫苗之母豬所生之新生仔豬有無腹瀉以及下痢情形，並且與無注射疫苗之母豬所生之新生仔豬對照其發病率。

參、結果

        1.動物試驗部份：

        表 1 為動物以口服方式用各種不同濃度之活菌做攻擊試驗之結果。

        第一組動物給予每毫升 10⁸ 細菌數者，第三組為其對照組，而第二組動物為給予每毫升 10⁷ 細菌數者，第四組則為其對照組。從表 1 所示可見未接種過疫苗之對照組 ( 即第三組和第四組 )，當給予每毫升 10⁸ 細菌數時，12 隻動物都下痢，若不及時治療則全數可因下痢症死亡。當給予每毫升 10⁷ 細菌數時，在 12 隻動物當中有 9 隻動物有下痢發生。反觀試驗組，無論給予的活菌數為每毫升 10⁸ 或 10⁷ 細胞數的第一組或第二組皆無下痢或任何異樣情形的發生。

        表 2 為以腸結紮法，將各不同濃度之活菌數注入腸內作攻擊試驗的結果。試驗組 ( 即第五組 ) 每隻動物的結紮腸子對注入各不同濃度的活菌懸浮液後，無任何陽性反應者的表現。而對照組 ( 即第六組 ) 以每毫升 10⁷ 活菌數作攻擊試驗時，有 31% ( 即 11／36 ) 的結紮腸子呈陽性反應。當以每毫升 10⁸ 活菌數給予時，則有 78% ( 即 28／36 ) 者為陽性反應。

        故從以上結果可知試驗組給予本疫苗時即可得到相當之免疫保護。

        2.田間試驗部份

        (一)接種疫苗之母豬抗體的測定：從表 3 可知，此試驗共在 8 處養豬場進行，接種疫苗之母豬共 1,760 頭，未接種之母豬為 440 頭。在接種疫苗前，母豬之 PHA 抗體力價大都低於或等於 1：4 者。而其抗毒素力價皆小於 1：2，僅 No. 1 豬場之母豬有高於 1：4 者。當疫苗接種後兩週內所得之 PHA 抗體力價可上升達 1：16 ~ 1：512 之間且可待續此抗體力價在 1：8 ~ 1：64 到仔豬離乳時。而抗腸菌素力價在疫苗接種後兩週時可高達 1：64 ~ 1：512 之間，在仔豬離乳時，其力價也在 1：64 ~ 1：256 之間。由此可見，本疫苗確實能賦予母豬提引出高力價的保護抗體。

        (二)預防新生仔豬下痢之功效：由表 4 所示，8 處養豬場的 1760 頭母豬所生產之 16422 頭仔豬中在 3 週期間的觀察顯示，共有 1190 頭仔豬發生下痢症，佔全仔豬數之 7%，而死亡數為 64 頭，佔全仔豬數的 0.38%。反觀在 440 頭未接種本疫苗之母豬所生產之 5189 頭仔豬中，三週齡內發生下痢症狀者有 1948 體，佔全仔豬數之 37.5%而其死亡頭數高達 24.7%，即死亡了 1282 頭仔豬。由此可見接種群母豬所生之仔豬與未接種者之白痢免疫成績顯著差異。

表 4：母豬接種過本疫苗與未接種者新產下之小豬 3 週期間下痢與死亡情形之比較表

        3.毒性試驗：

        表 5 乃為小白鼠注射疫苗作毒性試驗的結果。從表 5 可見，無論疫苗經由皮下或腹腔注液，小白鼠的食慾，體重無異常現象。因此，此疫苗對實驗動物是不具毒性。

表 5：仔豬白痢疫苗對小白鼠的毒性試驗

        表 6 則以懷孕母豬接種疫苗後的反應結果。在注射後，連續觀察七天發現在這些母豬的注射部份和其全身性情況均無任何不良反應。尤以懷孕後期母豬在注射本疫苗時亦無流產之現象發生。

表 6：仔豬白痢疫苗對懷孕母豬之毒性試驗

        由本試驗的結果可確定，使用本疫苗確無安全顧慮之憂。

        4.疫苗保存試驗：

        本疫苗在 4℃及室溫下放置後，在一年期間內的不同時間取樣而接種在健康家兔。經兩週，測定家兔血中抗體力價。表 7 表示，血中抗細菌體抗體力價達 1：32，及抗腸毒素之抗體力價達 1：16時，則此疫苗保存達到其效果。故知本疫苗不受溫度影響之保存且知保存一年期間也不影響其抗原性。

表 7：疫苗保存試驗之結果

                                        註：抗體力價以被動血球凝集反應測定時高於或等於 1：32者為

                                                合格，而抗腸毒素力價高於或等於 1：16者為合格。

肆、結論

        從結果顯示，本公司製備之仔豬白痢疫苗具有多項優點：

        (一)新生仔豬對於免除大腸菌引起之下痢症確實可經由接種本疫苗之母豬而獲得完全之保護力。

        (二)本疫苗對母豬無任何毒性，不僅不影響母豬之健康，也無造成流產之發生。

        (三)本疫苗無論在常溫或冷藏下保存時，其抗原力價在一年內能保持不變，故其貯存簡便。

        (四)母豬以低劑量接種本疫苗即能使仔豬獲得完全免除大腸菌引起之仔豬下痢症，本疫苗具有經濟實用之價值。

        由此可見本疫苗為經濟、安全、簡便及可靠的理想疫苗，值得推廣。

雜糧基金會決助北市推動雞肉分切銷售示範

        台灣區雜糧基金會決定撥款協助台北市政府，推動雞肉分切銷售示範，使我國家禽生產事業達到現代化經營的目標。

        雜糧基金會表示，由於我國家禽生產事業的蓬勃發展，不論在品種改良、生產技術、疾病防治方面，都已達到世界水準；但促進畜產品的消費，最重要的工作，乃在於銷制度的現代化與制度化，故擬與台北市政府市場管理處協商，辦理雞肉分切銷售示範。

        據台北市政府表示，該單位本年內新建市場戌德、北投、華山、水源、興隆等落成使用時，將在家禽零售攤位裝設冷凍櫃，辦理雞肉分切銷售示範，設置的冷凍櫃由雜糧基金會與台北市市場管理處各補助三分之一，其餘由業者自行負擔。

        台北市市場管理處為使各業者均能瞭解本項工作的目的，將舉辦講習會，指導電宰、分切、運銷及市場衛生、管理等業務，同時規定在新市場內禁止屠宰，以達維護消費者利益。

現代畜殖第十四集( 69年 7 ~ 12月 )、69年12月號 ( 84 ~ 89 )

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