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抑黴劑與吸附劑對黴菌之影響 鄭永祥 一、前 言： 黴菌可依其生活習性，區分為田間黴菌及倉貯黴菌兩類。飼料或穀物在進入倉庫儲存時，若濕度高時，易使黴菌發芽增殖，造成熱的產生與發黴，繼而使飼料結塊、變色或發黑，並產生黴菌毒素。穀物所寄生的黴菌是屬於絲狀菌(Filaments fungi)，可分為Mucor，Rhizapus，Aspergillus，Penicillum及Fusarium等五大類，其中以黃麴菌(Aspergillus flavus)所產生的毒素──黃麴毒素(Aflatoxins)對家畜禽的危害最大，不但影響動物之生長與生產，且被公認為致癌物質。 世界各國對麴毒素在動物飼料中分別訂有不同之標準。歐洲市場對混合飼料中黃麴毒素B1限量10∼50ppb；乳牛飼料20ppb，日本對花生粕中黃麴毒素B1限量為1000ppb，並限制其使用量。以色列則建議所有飼料均須在20ppb以下。美國則以飼料中含量20ppb為行政管理指標(Administrative guideline)。 二、各種抑黴劑之抗黴效果 抑黴劑在飼料或穀物上之使用；主依其酸性所致 ，而在抑黴劑之酸性特性上，最有效為Intact form即質子化型式(Protonated form)，而離子化(Ionic form)或鹽類(Salt form)其抑黴效果即較前者為差。良好之抑黴劑須具備以下四個條件： 1.經濟、便宜 2.無腐蝕性 3.低毒性 4.具有良好之抑黴效果。常被利用的有丙酸及其鹽類、醋酸、苯甲酸、山梨酸或清涼茶酸(Sorbic acid)，硫酸銅、龍膽紫。 Paster (1980)以雞飼料中添加丙酸鈣0.5％及丙酸0.3％，並維持飼料含水量在11.5∼13％間，以飼料中二氧化碳產生量之高低，做為抑黴劑有效性之指標。此乃因黴菌可利用飼料或穀物中之碳水化合物將之醱酵產生二氧化碳、熱及水的特性。結果0.3％丙酸添加組之抑黴效果達47日之久，較0.5％丙酸鹽添加組的12日，多了35日。由於丙酸其酸性強、危險性較大，使用操作時須特別小心，且其對金屬如飼料混合加工器械造成腐蝕，臭味亦是其缺點之一。故以丙酸鹽來添加，使用上較為安全，其一般以碳酸鈣化為攜帶劑，但抑黴作用遠遜於丙酸。 採取試驗期間飼料樣品，測其黴菌菌相，結果以Aspergillus candidus為最多，而Aspergillus flavus則較少，由此可推知其含黃麴毒素濃度不高。飼料之相對濕度於75∼95％時產熱主由黴菌而來，當相對濕度95％以上時主為細菌而來。試驗期相對濕度維持於80∼85％，故其熱之產生主為黴菌所造成；當溫度提高，伴隨二氧化碳昇高及黴菌數增加。 抗黴劑在液體培養基中之作用，是否一如在飼料中；此一乾性基質。Stewart等(1978)以2％酵母萃取物加上4％葡萄糖於26℃培養10日，在培養前分別加入Aspergillus parasiticus NRRL 2999及各種抗黴劑。如：丙酸及其Na，Ca鹽，龍膽紫，硫酸銅。結果發現丙酸及龍膽紫抑黴效果最佳。Dixon等(1981)以玉米粉為基質添加2％苯酸及清涼茶酸，將之置入錐形瓶中以29℃培養48小時，另外兩組為液體4％的醋酸及丙酸。以管中CO2形成量經氣相層析儀分析，作為抗黴效果的指標。當玉米粉中含20％水分時，以丙酸及苯酸之抗黴效果最佳。當水分維持35％時則以丙酸及青涼茶酸為最佳。由此可知丙酸的效果。一般而言，基質中所含水分量較高者，須獲得一定程度之抑黴作用時，抑制劑濃度須較高。 飼料或穀物若己發黴時；添加防黴劑時對飼料之營養價值或結果是否有改善作用。由於發黴玉米其脂肪含量下降約2.2∼3.9％，故其代謝能會下降。若日糧中添加油脂時是否有節約發黴玉米的效果。Bartox (1983)以日糧中有無發黴玉米及有無油脂添加(大豆油1.1％)及防黴劑丙酸或硫酸銅添加對一日齡∼三週齡之哈巴公雞作試驗。結果，發現發黴玉米之日糧其營養價值可經由應用大豆油之添加之抑黴劑──丙酸之使用而改善。防黴劑除上述介紹外，另外龍膽紫在畜產飼料之使用亦有之，但在水產飼料則忌諱，因其水中會呈現出藍紫色。Hall等(1981)測試龍膽紫於液態培養基中的抗黴效果，發現龍膽紫濃度於4μg／ml可使Aspergillus parasiticus黴菌芽胞生長被抑制。 |
| 表一 丙 酸 鈣 與 AGROSIL 對 粉 料 及 粒 狀 料 的 防 黴 效 果 | ||||||||
| 飼 料型 態 | 有否加水 | 防黴劑 | 貯存期間 | |||||
| 6天 | 30天 | |||||||
| 黴菌落數 | 脂 肪含 量 | 飼料中的水份含量 | 黴菌落數 | 脂 肪含 量 | 飼料中的水份含量 | |||
| 每克飼料菌 落 數 | ─── ％ ─── | 每克飼料菌 落 數 | ─── ％ ─── | |||||
| 粉 料
粒狀料 粉 料 粒狀料 粉 料 粒狀料 粉 料 粒狀料 |
－
－ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ |
－
－ － － CP CP AG AG |
1170
110 1775 253 1030 170 820 200 |
2.6
2.9 1.9 2.4 2.0 2.5 2.4 2.6 |
13.7
12.8 17.5 16.0 18.3 16.4 16.4 16.1 |
1.360
400 10.000 4.500 10.000 200 5.600 4.600 |
3.3
3.3 1.8 2.8 2.1 2.9 2.5 2.8 |
14.2
13.7 19.3** 16.1 19.2** 17.0 17.0 16.2 |
| CP和AG的添加量分別為0.3％和0.15％
*代表顯著性(＜.01) |
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Paster等(1985)以丙酸鈣與商業性防黴劑──Agrosil(主成分丙酸再加入四種酸所組成)測試在粉料 三、影響抗黴菌劑作用之因素 1.粒子大小： 影響抗黴菌劑作用之因素除抗黴劑選擇(Antifungal agent)及抗黴劑之濃度；使用何種黴菌菌株為指標(Indicator Microorganism)。明顯地；在抑黴菌之前理論上及實際上；抑制劑須與黴菌直接接觸。僅添加抗黴菌劑到飼料中並不夠；抗黴菌劑必須在飼料中均勻的分佈以便其與黴菌接觸，而飼料之粗細程度理論上應較抗黴菌劑粗細程度，對抗黴效果之產生影響為大。 Dixon et al, 1981即應用玉米粉為基質；添加0，0.125，0.5，1.0，2.0(mg／g)propionic acid以觀察飼料粒子大小對抗黴劑作用之影響。Corn meal之粒子分四級，＜0.15mm，0.59∼0.83mm，1.41∼1.65mm，＞2.36mm。Corn meal＋propionic acid加入培養瓶中(10×150mm)＋Septa再抽取其內CO2濃度以GC測定之。其結果示於圖1：
抑黴劑之效果隨粒子變小而變佳；此因粒子小；則Propionic acid可以更均勻分散；而利於抑黴作用之進行。 接著應用含水量35％之玉米粉為基質，當隨著粒子變小其CO2產生之濃度下降。其抗黴效果為：＜0.15mm＞0.59∼0.83mm＞1.41∼1.65mm＞2.36mm。如圖2所示。
2.水分含量： 飼料或穀物中之水分含量直接影響到飼料或穀物中黴菌之發育繁殖。 Dexon et al (1981)以白肉雞前期料及Cornｍ meal為基質。分別加入不同量之合成抗黴劑Mold-X；其成分為含4種酸之混合並以CaCO3為賦形劑。 其結果示於圖3及圖4。隨水分含量之增加；抗黴劑使用須達到一定之抗黴效果時，抗黴劑量必須提高；如以最小抑制濃度MIC (Minimum Inhibition Concentration)在20％ H2O處理組時Mold-X為0.125 mg／g，而25％ H2O時0.5 mg／g；35％ H2O處理組時MIC為1.0 mg／g。
作者提及測定黴菌生長的指標，其方法有(1)Glucosamine──細胞壁組成分。(2)熱之產生。(3)CO2之產生，(4)毒素之產生；其中以CO2之產生為代表黴菌呼吸作用之結果，乃為初期代謝產物；易於準確而容易測定。 Dixon et al另外應用Corn meal為基質以測定不同水分含量20％，25％，35％水分下Mold-X之抗黴效果。與圖3比較，圖4中CO2的產生量較高，表示Corn meal中所含之碳水化合物有利於黴菌之生殖與發育。其MIC在20％ H2O為0.125 mg／g；25％ H2O時為0.25 mg／g；35％ H2O時為0.5 mg／g；顯示含水量之提高；使得飼料易於結塊(Caking)不易於Mold-X添加時之攪拌均勻。 3.單位原料對抗黴作用之影響： Dixon et al, 1981由上述之實驗發現Corn meal對Mold-X之抑黴作用有拮抗作用(antagonisis)；而白肉雞前期飼料之拮抗較小。作者於是利用各種單位原料，大豆粕，家禽副產粉，及魚粉(fish meal)，脂肪為基質，其中以Corn meal將之稀釋成各種不同百分比；測試Propionic acid之抗黴作用是否受上述單位原料所影響，其結果示於圖5。
當大豆粉逐漸由10％增加至50％時；漸顯出拮抗效果；魚粉之添加及玉米筋粉(Corn gluten meal)之添加亦有相同之拮抗效果；而圖6之家禽副產粉(poulty by-product)亦有拮抗作用；其為何有此一結果；作者解釋為丙酸的游離酸形式被轉變成為較不具有活性之鹽類形式(Salt form)，藉由飼料組成分中的緩衝效果(Buffering effect)有關；舉凡魚粉(fish meal)，大豆粉、Poulty by-product meal均為富含蛋白質之飼料原料；因蛋白質為胺基酸所組成；胺基酸為一雙極性物質；以Zwitterion存在；所以為一良好緩衝物質(Lehinger, 1975)，但更可能之解釋為Corn gluten meal其鹼性胺基酸(basic amino acid)含量少：諸如Lysine，Arginine較少故缺乏中和酸之能力。
當脂肪添加於玉米粉(Corn meal)時，可增加丙酸之抗黴效果；脂肪具有此一協同作用(Synergenetic effect)可以解釋為；增加液態丙酸(liquid form)之分散(distribution)，抗黴劑之活力(activity)受飼料組成所影響；此對於飼料單位原料選用及使用量上具有參考價值。請參閱圖7。
四、吸附劑對Aflatoxin之吸附作用 黃麴毒素不易被破壞，故打粒及加工對其影響少，且其不具抗原性(antigenicity)，故無法經由免疫進行而達到預防之效果。而污染含黃麴毒素之飼料；利用或將之拋棄有無數的困難及嚴重的經濟問題。現今仍無任何可靠而足以實際應用之方法；而須經由避免或進行Aflatoxin之移除。較經濟而可行之方法；乃發展一無毒之日糧添加物減毒物質；可使家禽或動物對其更具有抵抗力；例如日糧含高量的脂肪；或蛋白質、金黴素(Aureomycin)、抗生素(Antibiotics)或維他命混合給予之日糧；加以減低Aflatoxin的毒性作用；亦可利用吸附劑(Absorbent)以減少Aflatoxin在生體內之吸收。 Phillip et al (1988)使用三種吸附劑作為評估其在液體容器中吸收Aflatoxin之百分率；其中以矽酸鋁(Aluminum silicate)之吸附能力較明礬(Aluminas)及矽酸(Silicate)為佳。AFB1吸收99％對29％ and 82％。而後作者利用飼料添加Aflatoxin B1 75mg／kg及0.5％ Hydrated Sodium Calcium Aluminosilicate (HSCAS)以Hyline W-36之公來航鳼作為期0∼4wks試驗；另以Hubard×Hubard公肉雞進行0∼3wks齡之試驗；其結果示於圖8；由表中可知0.5％ HACAS之添加具有保護雞隻免受AFB1之毒害作用；HSCAS為具有多孔質之物質；對Aflatoxin具有強力之親和性(Affinity)。在來航雞之效果較白肉雞之效果為佳。HSCAS經與Affatoxin結合後降低其在生體內之生物可利用性(bioavailability in vivo)。
飼與0.5％ HSCAS及Aflatoxin之雞隻肝臟與單獨餵與7.5 mg／kg AFB1之雞隻肝臟比較時可見；AFB1餵飼組肝臟明顯地較膽弱(Friable)及蒼白。而添加0.5％ HSCAS肝臟則紅潤趨於正常。 因此此一抗結塊劑及其他同種之aluminosilicate證實在預防黃麴毒素的(Aflatoxicosis)之管理上；相當有效。 Dalvi等人於1984應用活性炭(Active charcoal)；為吸附劑；且應用水中添加0.05％Reduced glutattione還原態之麩胺酸及0.05％ Phenobarbital。 以Hubard×Hubard種肉雞0∼4wks齡為試驗期5∼8wks日糧中採未添加藥物前期料。再以10ppm AFB1對雞隻加以攻毒。測試上述藥物對雞隻的保護作用。 飲水中添加之Phenobarbital為一種麻醉劑；當雞隻或動物食入後可以使得肝臟中微粒體混合功能氧化鋛系統(Microsomal mixed Function Oxidase System, MFO)中Cytochrome P-450之活性提高25倍(25-fold)；而cytochrome P-450具有加氧作用(Monooxygenase)；在動物體去毒機構(detoxification mechanism)中扮演phase Ｉ，第一期的作用；即在AFB1𨧤喃環(Furan ring)中8.9碳雙鍵上加入氧；形成Aflatoxin B1 - 8,9 - oxide。其作用徑路(Pathway)示於圖9。 在表2中可知當AFB1 10 ppm添加時cytochrome P-450活性及Benphetamine tabolism以每分鐘，每克微粒體蛋白質所產生之甲醛量，Benphetamine為一種藥物可經由肝代謝成為甲醛(formaldehyde)，但當AFB1 10 ppm加入時造成肝臟受損使其在肝中代謝速率下降；而SGOT (Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase)活力因肝臟被破壞；造成細胞膜破裂或滲透性增加使原存於細胞質中之SGOT自肝中流入血中，故其可為肝臟疾患之指標。
當飲水中添加GSH；或飼料中添加Activated charcoal時細胞色素P-450增加表示detoxification進行加速；且Benzphetamine代謝量增加；SGOT稍降；顯示其具有保護功能。而phenobarbital添加飲水時；cytochrome P-450顯著較其他各組為高(P＜0.05)顯示其具有Induce作用。 GSH之結構乃為三種胺基酸所組成為強之還原劑；可提供H+給epoxideo使之經由cytochrome P-450代謝AFB1而來之AFB1 - 8,9 - oxide形成羥化物(hydroxylation之 GSH-AFB1之無毒性)物質；且呈水溶性；易於排出體外，圖10，11所示。
Cytochrome P-450另可代謝AFB1成為AFO1為毒性較弱之化合物；且經由P-448代謝為AFM1；毒性亦弱，如圖12示。 |
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