猪大肠菌毒素菌苗(Ecotosin)

台湾家畜生物化学制药厂提供

壹、绪言

        病原性大肠杆菌 ( Enteropathogenic  Escherichia  coli ) 的感染为引起仔猪下痢原因之一已为不争的事实 ( 2、5、7 )。

        大肠杆菌使仔猪致病的机转，其一为此菌定能产生并分泌肠毒素 ( Enterotoxin )，引起类似人的霍乱般的严重下痢现象 ( 1、3、4 )，其二则是此菌具有侵人并伤害肠道粘膜组织之能力而造成严重肠炎 (6)，肠毒素有耐热性 ( Heat  stable , ST ) 和非耐热性 ( Heat  labile , LT ) 等两类 ( 1、2、8 )，後者为具有抗原性的蛋白质，因此可以免疫注射使注射的动物产生抗体以中和肠毒素而免除疾病的发生。因此，要仔猪免於大肠杆菌感染後所引起的下痢，则仔猪体内必须同时兼有抗细菌体抗抗原之抗体和有抗肠毒素之免疫抗体。鉴於新生仔猪有免疫系统的缺陷，不能於出生数日即具免疫能力，故其免疫力的获得，皆来自吸取高浓度单位的抗体之母猪初乳。

        本公司多年来致力发展一种同时具有对抗致病性大肠菌引起下痢两种不同机转的混合疫苗，即仔猪白痢疫苗，并以此疫苗进行实验动物接种及田间应用试验。经多次的改进及探讨，确认本疫苗对母猪具有高度的安全性且能提引出高单位浓度之抗体，对新生仔猪的大肠菌感染下痢症具有预防效果。

        本报告为以本公司制备之仔猪白痢疫苗所进行之实验两年来累积所得之研究成绩的报告。

贰、试验材料与方法

        1.菌株：本疫苗所用菌株由全省多所养猪场得病仔猪粪便中分离所得。所有菌株以 Trypticase  soy  agar ( Difco ) 作继代培养及保存。其中有些菌株以免肠结扎试验 (5)及老鼠肾上腺细胞 ( Y 1 ) 试验 (9) 而知具有产肠毒素能力。

        2.肠毒素之制备：将产毒菌株接种在 Trypticase  soy  broth ( Difco )，经 48 小时 37℃温度下培养後，以离心方法除去菌体，其上清液用阴离子交换纤维处理後获得含高浓度肠毒素之溶液。此溶液置於负 20℃温度保存以供疫苗调配之用。

        3.疫苗之制备：个别培养後的各不同菌株，以高速离心法收集菌体，以一定单位浓度的肠毒素溶液相混合後，添加 0.2%福马林溶液放置於 4℃冷藏库静置之。经一个月以上时间的处理後，菌液再以磷酸缓冲溶液 ( 0.005 MPBS，pH 7.0 ) 调整菌液浓度为每毫升 10⁸ 个细胞数时，即为疫苗制品。除疫苗作为基础免疫用时混合铝胶当辅剂外，补强用疫苗皆为不含铝胶之含肠毒疫苗。

        4.疫苗保存试验：本疫苗分别保存於 4℃及室温 ( 25 ~ 30℃ ) 之中，然後分别在每个月取样并进行检定其效力，观察其保存性，以 5 只平均体重 2.5 公斤之健康白兔，接种疫苗 2 毫升在肌肉侧肌肉经两周，由耳动脉采血并测定血液中抗体力价。

        5.动物试验：由兔商买进後在本公司饲养的白兔进行试验。以 12 周龄左右之白兔分成六组，每组动物只数均为 12 只。第一组、第二组和第五组的动物用做疫苗免疫组，而其他的第三组、第四组和第六组则为前三组之对照组，对照组的各组动物则以磷酸缓冲溶液代替疫苗接种。

        以等量的疫苗和铝胶辅剂混合而成之溶液，用每只白兔 2 毫升的量，以肌肉注射给予免疫组作基础免疫注射。两周後，免疫组动物再以肌肉注射方法每周注射疫苗 2 毫升，连续两周。

        6.活菌攻击试验：各组动物经两次补强注射後的第七天进行本试验。经 24 小时培养的大肠菌菌液，以远心分离法收集菌体，然後用原培养液为稀释液稀释收集的菌体成为特定浓度的菌液 ( 如表 1、2 )，然後以口服方式和肠结扎试验做菌攻击试验。以口服活菌攻击者观察动物一周内有无下痢发生。而以肠结扎试验者，则在活菌攻击後 18 小时观察肠中内容物量的增加和发炎现象。在肠结扎试验，活菌的每一悬浮液皆注入每只动物的不连续之三段，每段长度为五公分的结扎肠子内以进行试验。

表 1：口服活菌攻击试验之结果

表 2：肠结扎之活菌攻击试验结果

        7.田间试验：本试验在台南县和高雄县地区的八处养猪场进行。

        除表 3 所列之 No. 1 养猪场的母猪都曾由该场兽医师以口服和注射接种其自家泡制之大肠菌液外，其他养猪场，其新生仔猪均受到病原性大肠菌感染有下痢之记录者。

表 3：本疫苗接种前後母猪之抗体力价

        试验组所有母猪皆於产前五周左右接种疫苗一次，再於产前两周作补强疫苗接种。接种方式，皆在母猪左右耳後皮下轮番接种五毫升疫苗。於每次接种疫苗两周内由接种兽医师负责抽取母猪血液分离其血清，并以动物血球凝集反应及中和试验测定血中抗细菌体抗原之抗体和抗肠毒素抗体力价。

        8.被动红血球凝集反应 ( Passive  hemagglutination  test , PHA ) 试验：本试验为测定血液中抗血菌抗原之抗体力价者。

        大肠菌抗原是以经 24 小时培养之细菌，离心後用磷酸缓冲液精洗两次，其悬浮液置於 100℃之水槽中 2 小时。离心後取其菌体并以 0.2%，福马林处理，即成所要之抗原。

        致敏性红血球则由 0.2 毫升新鲜绵羊红血球用 20 毫升 0.85%盐水清洗两次，并作成 2.5%悬浮液，在加入等体积之 0.005%鞣酸混合後，置於 37℃下 10 分钟。然後以磷酸缓冲液清洗一次作成 5%悬浮液。

        在 37℃下，等体积之红血球和细菌抗原充分搅拌 2 小时，即成致敏性红血球。

        被动红血球凝集反应是在 V 字型底盘 ( V  shape  microtiter  plate ) 中进行。将血清以 2 倍连续系列稀释法稀释後，加入等量之致敏性红血球悬浮液，静置 2 小时後观察盘底之血球凝集反应。抗体力价则为阳性反应之血清最高稀释倍之倒数。

        9.中和试验：本试验为测定抗毒素抗体力价之反应者。将 2 倍连续系列稀释之血清与已知抗原力价之肠毒素混合後放入此混合液於老鼠肾上腺细胞株培养上，并於 18 小时内观察抑制细胞毒性反应现象。抗毒素抗体力价为能抑制细胞毒性反应之血清最高稀释倍之倒数。

        10.毒性试验：检定疫苗之安全性时，以小白鼠和怀孕两周之母猪分别进行之。以每周 0.5 毫升之剂量以皮下和腹腔注射方式各接种小白鼠 10 只。而怀孕母猪 10 只则每只给予 5 毫升之剂量，在耳後做皮下接种。然後逐日观察小白鼠之体重增减健康情形，母猪则观察其食欲、体温或流产有否之情况等等之反应，同时也观察接种疫苗之母猪所生之新生仔猪有无腹泻以及下痢情形，并且与无注射疫苗之母猪所生之新生仔猪对照其发病率。

参、结果

        1.动物试验部份：

        表 1 为动物以口服方式用各种不同浓度之活菌做攻击试验之结果。

        第一组动物给予每毫升 10⁸ 细菌数者，第三组为其对照组，而第二组动物为给予每毫升 10⁷ 细菌数者，第四组则为其对照组。从表 1 所示可见未接种过疫苗之对照组 ( 即第三组和第四组 )，当给予每毫升 10⁸ 细菌数时，12 只动物都下痢，若不及时治疗则全数可因下痢症死亡。当给予每毫升 10⁷ 细菌数时，在 12 只动物当中有 9 只动物有下痢发生。反观试验组，无论给予的活菌数为每毫升 10⁸ 或 10⁷ 细胞数的第一组或第二组皆无下痢或任何异样情形的发生。

        表 2 为以肠结扎法，将各不同浓度之活菌数注入肠内作攻击试验的结果。试验组 ( 即第五组 ) 每只动物的结扎肠子对注入各不同浓度的活菌悬浮液後，无任何阳性反应者的表现。而对照组 ( 即第六组 ) 以每毫升 10⁷ 活菌数作攻击试验时，有 31% ( 即 11／36 ) 的结扎肠子呈阳性反应。当以每毫升 10⁸ 活菌数给予时，则有 78% ( 即 28／36 ) 者为阳性反应。

        故从以上结果可知试验组给予本疫苗时即可得到相当之免疫保护。

        2.田间试验部份

        (一)接种疫苗之母猪抗体的测定：从表 3 可知，此试验共在 8 处养猪场进行，接种疫苗之母猪共 1,760 头，未接种之母猪为 440 头。在接种疫苗前，母猪之 PHA 抗体力价大都低於或等於 1：4 者。而其抗毒素力价皆小於 1：2，仅 No. 1 猪场之母猪有高於 1：4 者。当疫苗接种後两周内所得之 PHA 抗体力价可上升达 1：16 ~ 1：512 之间且可待续此抗体力价在 1：8 ~ 1：64 到仔猪离乳时。而抗肠菌素力价在疫苗接种後两周时可高达 1：64 ~ 1：512 之间，在仔猪离乳时，其力价也在 1：64 ~ 1：256 之间。由此可见，本疫苗确实能赋予母猪提引出高力价的保护抗体。

        (二)预防新生仔猪下痢之功效：由表 4 所示，8 处养猪场的 1760 头母猪所生产之 16422 头仔猪中在 3 周期间的观察显示，共有 1190 头仔猪发生下痢症，占全仔猪数之 7%，而死亡数为 64 头，占全仔猪数的 0.38%。反观在 440 头未接种本疫苗之母猪所生产之 5189 头仔猪中，三周龄内发生下痢症状者有 1948 体，占全仔猪数之 37.5%而其死亡头数高达 24.7%，即死亡了 1282 头仔猪。由此可见接种群母猪所生之仔猪与未接种者之白痢免疫成绩显着差异。

表 4：母猪接种过本疫苗与未接种者新产下之小猪 3 周期间下痢与死亡情形之比较表

        3.毒性试验：

        表 5 乃为小白鼠注射疫苗作毒性试验的结果。从表 5 可见，无论疫苗经由皮下或腹腔注液，小白鼠的食欲，体重无异常现象。因此，此疫苗对实验动物是不具毒性。

表 5：仔猪白痢疫苗对小白鼠的毒性试验

        表 6 则以怀孕母猪接种疫苗後的反应结果。在注射後，连续观察七天发现在这些母猪的注射部份和其全身性情况均无任何不良反应。尤以怀孕後期母猪在注射本疫苗时亦无流产之现象发生。

表 6：仔猪白痢疫苗对怀孕母猪之毒性试验

        由本试验的结果可确定，使用本疫苗确无安全顾虑之忧。

        4.疫苗保存试验：

        本疫苗在 4℃及室温下放置後，在一年期间内的不同时间取样而接种在健康家兔。经两周，测定家兔血中抗体力价。表 7 表示，血中抗细菌体抗体力价达 1：32，及抗肠毒素之抗体力价达 1：16时，则此疫苗保存达到其效果。故知本疫苗不受温度影响之保存且知保存一年期间也不影响其抗原性。

表 7：疫苗保存试验之结果

                                        注：抗体力价以被动血球凝集反应测定时高於或等於 1：32者为

                                                合格，而抗肠毒素力价高於或等於 1：16者为合格。

肆、结论

        从结果显示，本公司制备之仔猪白痢疫苗具有多项优点：

        (一)新生仔猪对於免除大肠菌引起之下痢症确实可经由接种本疫苗之母猪而获得完全之保护力。

        (二)本疫苗对母猪无任何毒性，不仅不影响母猪之健康，也无造成流产之发生。

        (三)本疫苗无论在常温或冷藏下保存时，其抗原力价在一年内能保持不变，故其贮存简便。

        (四)母猪以低剂量接种本疫苗即能使仔猪获得完全免除大肠菌引起之仔猪下痢症，本疫苗具有经济实用之价值。

        由此可见本疫苗为经济、安全、简便及可靠的理想疫苗，值得推广。

杂粮基金会决助北市推动鸡肉分切销售示范

        台湾区杂粮基金会决定拨款协助台北市政府，推动鸡肉分切销售示范，使我国家禽生产事业达到现代化经营的目标。

        杂粮基金会表示，由於我国家禽生产事业的蓬勃发展，不论在品种改良、生产技术、疾病防治方面，都已达到世界水准；但促进畜产品的消费，最重要的工作，乃在於销制度的现代化与制度化，故拟与台北市政府市场管理处协商，办理鸡肉分切销售示范。

        据台北市政府表示，该单位本年内新建市场戌德、北投、华山、水源、兴隆等落成使用时，将在家禽零售摊位装设冷冻柜，办理鸡肉分切销售示范，设置的冷冻柜由杂粮基金会与台北市市场管理处各补助三分之一，其馀由业者自行负担。

        台北市市场管理处为使各业者均能了解本项工作的目的，将举办讲习会，指导电宰、分切、运销及市场卫生、管理等业务，同时规定在新市场内禁止屠宰，以达维护消费者利益。

现代畜殖第十四集( 69年 7 ~ 12月 )、69年12月号 ( 84 ~ 89 )

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