黄麴毒素Ｂ₁对鸭周边血液淋巴细胞
之致害作用及β－胡萝卜素对其保护效果

郑永祥⁽¹⁾    庞    飞⁽²⁾

收件日期：84年10月26日；接受日期：85年1月29日

摘   要

        本试验之目的为建立以MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)方法进行鸭周边血液淋巴细胞增殖作用之测定，并利用此法探讨黄麴毒素B₁ (AFB₁)对鸭周边血液淋巴细胞之致害作用和β－胡萝卜素(BC)对其保护效果。

        试验一：在以MTT法进行裂殖原的比较中显示，三种裂殖原中OD值以phytohaemagglutinin，(PHA；0.603)的增反应最佳。pokeweed mitogen，(PWM；0.421)次之，而concanavalin A，(Con A；0.395)最差。回归方程式经一次微分计算增殖反应所须最佳裂殖原浓度分别为PHA 23.68μg／ml、Con A 34.48 μg／ml和PWM 23.57 μg／ml。试验二：淋巴细胞数对MTT之反应呈二次曲线，当细胞浓度自1×10⁴提高至1×10⁷ cell／ml时，随着细胞数目的增加其OD值则呈降低的趋势。试验三：结果显示AFB₁处理组自高量(1×10⁴ ng／ml)至低量时(1×10¹ ng／ml)，其OD值显着(P＜0.05)较单独PHA处理组为低，但AFB₁在极低量(1×10^-2 ng／ml)时对淋巴细胞增殖无抑制作用。当高浓度AFB₁ (1×10⁴ ng／ml)微粒体代谢後，较未经微粒体代谢AFB₁显着(P＜0.05)抑制淋巴细胞增殖作用，但低浓度(1×10¹、1×10^-2 ng／ml)时则抑制作用不显着。试验四：结果显示单独高浓度BC (0.1 μM)添加时，OD值显着(P＜0.05)较培养基对照组为高。且中低浓度BC (0.05、0.025μM)添加於AFB₁经微粒体代谢之培养系统中时对细胞增殖率则无改善之效果。然而高浓度BC (0.1 μM)添加於AFB₁经微粒体代谢之培养系统中时，显着的(P＜0.05)较中低浓度BC者之细胞增殖率为高，且改善至与单独PHA刺激的对照组相同之细胞增殖率。

        综观本试验结果显示高浓度AFB₁ (10⁴ ng／ml)经代谢後对鸭淋巴细胞增殖作用的抑制性有增强的效果，而高浓度B－胡萝卜素(0.1 μM)可保护鸭淋巴细胞免除此一毒害作用。(关键语：鸭、黄麴毒素B₁、淋巴细胞、β－胡萝卜素)

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(1)国立宜兰农工专科学校畜产科。

(2)国立台湾大学兽医学系。

绪   言

        黄麴毒素B₁ (AFB₁)具有免疫抑制性(Pier et al., 1977)，且抑制phytohaemagglutinin (PHA)所诱发之鸭淋巴细胞转型作用(郑与庞，1994)，其致害可能为AFB₁经肝脏微粒体作用(郑与庞，1994-5)，其致害可能为AFB₁经肝脏微粒体作用代谢为毒性较高之氧衍生自由基(oxygen-derived free radical)所致(Neldon-Ortiz and Qureshi, 1991)，过去β-胡萝卜素 (β-carotene)一直局限於维生素原A (Provitamin A)的角色，但最近的研究发现，β-carotene不须先转变为维生素A即可有效清除新生态氧和过氧化自由基(Chew, 1993aKadian et al., 1988)，在家畜日粮中具有免疫调节的功能，先前的研究显示β-carotene可促进鼠毒杀性T－细胞的增殖、增加裂殖原所诱发之鼠(Bendich and Shapiro, 1986)、猪淋巴细胞转型反应及巨噬细胞之tumor necrosis factor (TNF)活性(Bendich, 1991)及与维生素E协同增强鸡对疾病抵抗力和降低因Escherchia Coli感染之死亡率(Tengerdy et al., 1990)。

        生物学上常需测定细胞存活率及增殖作用，其方法包括有trypan blue染色法、放射法核鶺酸并入法(3H-thymidine incorperation)。另外；快速呈色法，其主要依赖粒线体中琥珀酸去氢鶤之作用将MTT 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)之tetrazolium转为蓝色之产物MTT formazan (Mosmann, 1983；Denizot and Lang, 1986)。MTT转变仅在存活细胞中进行，且formazan形成量与数目呈正比，由於拥有快速、经济和无放射性元素污染之问题，故常被使用为细胞存活率及巨噬细胞吞噬能力之测定，且经比较MTT呈色法所测定禽类细胞存活率与放射性核鶺酸并入法之结果相关性可达0.8 (Bounous et al., 1992)。

        本试验之目的即在以MTT方法探讨试管内鸭淋巴细胞最佳裂殖原及浓度、细胞数及黄麴毒素B₁对鸭周边血液淋巴细胞之致害作用和β-carotene对其保护效果。

材料与方法

一、实验动物及试验液制备

        以成熟之产蛋菜鸭做为血液供应鸭，采血期间鸭只采笼饲，饲料及饮水均自由采食。

        鸭淋巴细胞之分离与纯化系采用郑与庞⁽¹⁾之方法。先自鸭翼下静脉采血10ml，以EDTA (0.2％)为抗凝剂。该血液，经4℃，1300×g下离心30分钟，收集白血球层，与合0.2％EDTA之等量 0.2M phosphate buffer solution (PBS, pH 7.2, 41℃)混合。再将之置於等量Ficoll-Paque (density：1.077；Sigma, St Louis, Mo., USA)上於4℃，200×g下离心25分钟，将细胞层吸出，先以0.2 M PBS清洗一次，於4℃，200×g下离心10分钟後再以含EDTA (0.2％)之RPMI-1640清洗两次，取得纯度95％以上淋巴细胞。将细胞悬浮液以含20％胎牛血清、青霉素(100U／ml)、链霉素(100 μg／ml)及 1％ L-glutamine之RPMI-1640调整最终细胞浓度为1×10⁷淋巴细胞／ml。

        MTT溶液制备：将MTT (Sigma, M2128)以0.2 M PBS调整为 5 mg／ml之原液，经0.2μm millipore过滤，以铝箔纸密封遮光置於4℃保存备用。

        裂殖原之制备：phytohaemagglutinin (PHA)、pokeweed mitogen (PWM)及concanavalin A (Con A)等三种裂殖原。先以含20％非动化胎牛血清之培养用RPMI-1640调整为5mg／ml之原液备用。

        黄麴毒素B₁制备：将纯品AFB₁结晶5 mg (Sigma, A6636)，先以0.5ml二甲亚枫(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解，再以0.2 M PBS调整为1mg／ml之原液，以铝箔纸密封遮光置於－20℃保存备用。

        β-carotene制备：将β-carotene 10 mg之纯品(Sigma, C-0126)先以绝对酒精溶解，再以0.2 M PBS 10 ml调整为1 mg／ml之原液，以铝箔纸密封遮光置於－20℃保存备用。

        肝脏微粒体之制备：取鸭肝脏40g置於200ml冰冷之0.2 M PBS中，将肝脏剪碎。使用均质机(Ace homogenizer, Nissei AM-5)予以均质，再以组织研磨机(Wheaton overhead stirrer)研磨来回三次。均质液以10000×g离心15分钟(HIMAC, CR21)使细胞核及粒线体沉淀，上清液以100000×g离心60分钟，倒去上清液後将沉淀之肝细胞微粒体，以0.2 M PBS稀释为5mg／ml微粒体蛋白质之原，微粒体蛋白质含量系依Peterson (1977)修定Lowry et al. (1951)所发表的方法测定之，以牛血清白蛋白做为蛋白质标准。

        NADPH之制备NADPH (Sigma, St. Louis, MO., USA)，以0.2 M PBS调整为0.25 mM溶液，再以铝箔纸密封遮光置於－80℃保存备用。

        淋巴细胞存活率分析：将50ul，1×10⁷ cells／ml之鸭淋巴细胞和20μl浓度为125μg／ml之PHA，并以RPMI-1640调整使各孔之总体积为250μl置入96孔U型之微量培养皿中，於41℃，含5％ CO₂之湿压恒温箱中培养72小时，培养结束前4小时，经800×g离心5分钟，并吸除上清液，将浓度5mg／ml的MTT 20 μl及RPMI-1640  80μl加入微量培养皿中，时间到後经800×g离心5分钟，并吸除上清液且於每孔中加100μl之acid isopropanol (0.04 N HCl／isopropanol)。经由振荡以溶解所形成之蓝色formazan结晶，於波长560nm下以ELISA reader读取OD值，每一试验之处理使用6个孔。

二、试验处理

        试验一：不同裂殖原PHA、Con A及PWM於不同浓度(0、5、10、20和40 μg／ml)加入培养系统中，最终细胞浓度为1×10⁷淋巴细胞／ml，以探讨最佳MTT反应之裂殖原与浓度。

        试验二：不同鸭淋巴细胞浓度(1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸ cell／ml)加入培养系统中，以探讨最佳MTT反应之细胞浓度。

        试验三：培养系统加入不同最终浓度之黄麴毒素B₁ (1×10⁴、1×10¹、1×10^-2 ng／ml)及有无添加肝脏微粒体，以探讨黄麴毒素Ｂ₁代谢与否对鸭淋巴细胞毒害作用，最终细胞浓度为1×10⁷淋巴细胞／ml。试验处理详如表1。

表一 以MTT法测定黄麴毒素B₁对鸭淋巴细胞毒害作用之试验处理

Table 1. The experimental design of cytotoxic effect of aflatoxin B₁ on duck lymphocytes by MTT assays

Lymphocytes

(1×10⁷／ml)

AFB₁

PHA

(200μg／ml)

MIC

(12.5 mg／ml)

NADPH

(0.25 mM)

Total

50

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50

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表二 以 MTT 法 测 定 黄 麴 毒 素 B₁ 对 鸭 周 边 血 液 淋 巴 细 胞 之 致 害 作 用 及 β- 胡 萝 卜 素 对 其 保 护 效 果 之 验 处 理

Table 2.  The experimental design of cytotoxic effect of aflatoxin B₁ on duck lymphocytes and protective activity of β-carotene by MTT assays

Lymphocytes

(1×10⁷／ml)

AFB₁

PHA

(200μg／ml)

betacarotene

MIC

(12.5 mg／ml)

NADPH

(0.25 mM)

Total

50

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－

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50

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三、统计分析

        实验所得之资料先经一般线性模式(general linear model；GLM)进行变方分析，再以邓肯氏新多项变域法(Duncan's new multiple range test)比较各组间差异显着性。

结果与讨论

        不同裂殖原PHA、Con A及PWM於不同浓度(0、5、10、20和40μg／ml)加入培养系统中，以探讨最佳MTT反应之裂殖原与浓度，结果示於图1。资料经多项式(polynominal)回归所绘之回归曲线图，由曲线图可知裂殖原以PHA刺激增殖反应最佳，PWM次之，而ConA最差。回归方程式经一次微分求得增殖反应所须最大裂殖原浓度分别为PHA 23.86μg／ml、Con A 23.57 μg/ml和PWM 34.48 μg／ml。鸭周边血液淋巴细胞不同浓度对MTT存活率之反应，示於图2淋巴细胞数对MTT之反应呈二次曲线，当细胞浓度自1×10⁴提高至1×10⁷ cell／ml时，淋巴细胞数目持续增加其OD值亦升高，当细胞浓度再增加到1×10⁸ cell／ml时OD值呈降低的趋势，推测此一细胞浓度在经72小时培养後，营养分可能为其增殖之限制因子，亦即胎牛血清已用尽，由此一结果显示以MTT方法测定鸭淋巴细胞之存活率以1×10⁷ cell／ml最为适当，此一结果与Lessard and Dupuis (1994)试验使用之细胞数一致。不同家畜禽之淋巴细胞表面之裂殖原受体数目与特性不一，对同一裂殖原反应时之最佳细胞数互异(Talebi et al., 1995)。

　　肝脏微粒体为细胞经均质化裂解而来，内质网断裂後，再组合而成大小约100nm之小泡(Forrester et al., 1990)，其富含多种酵素，其中以cytochrome p450在黄麴毒素B₁代谢转化为8,9-epoxide毒性增强(Ramsdell and Eation, 1990)。Neldon-Ortiz and Qureshi (1991)以经微粒体代谢之黄麴毒素B₁作用鸡腹腔巨噬细胞1小时，则发现微粒体使黄麴毒素B₁毒性增强，甚至0.5μg／ml之浓度亦造成细胞形态改变，黏附力及吞噬能力亦明显降低。相较本试验使用之浓度10⁴ ng／ml等於10 μg／ml，意即以淋巴细胞存活率来评估黄麴毒素B₁经代谢之毒性上比以巨噬细胞之形态学、黏附力及吞噬力为评估指标较不敏感。Pang and Pan (1994)以猪淋巴细胞为对象，结果显示黄麴毒素B₁浓度於5×10⁴ ng／ml处理12小时，猪淋巴细胞死亡率即达50％。

　　经微粒体代谢之AFB₁ (10⁴ ng／ml)同时加入β－胡萝卜素(BC)对鸭周边血液淋巴细胞存活率之影响，结果示於图4。单独微粒体处理与培养基对照组间无显着差异，而当单独高浓度BC (0.1 μM)添加时，OD值显着(P＜0.05)较培养基对照组为高，显示BC为一潜在性裂殖原。单独AFB₁ (10⁴ ng／ml)显着(P＜0.05)较AFB₁经微粒体代谢者之细胞存活率为高，且中低浓度BC (0.05、0.025 μM)添加於AFB₁经微粒体代谢之培养系统中时对细胞存活率并无改善之效果。然而高浓度BC (0.1 μM)添加於AFB₁经微粒体代谢之培养系统中时极显着的(P＜0.05)较中低浓度BC者之细胞存活率为高，且改善至单独PHA对照组相同之细胞存活率。

　　Chew et al., (1993b)实验指出仔牛一次口服胶囊化BC 200 mg时，可提高淋巴细胞对BC之摄取量，但白血球及红血球对BC摄取量无影响。进一步分析淋巴细胞之胞器。发现粒线体、胞核及微粒体中BC含量着增加，但仔牛血浆中BC及视觉醇含量无影响。本试验之BC (0.1 μM)添加可有效的提高淋巴细胞存活率，可能与提高淋巴细胞对BC之摄取有关；虽然对於BC在调节免疫力上所扮演的角色尚不了解，但BC可能以自由基清除者抵抗自由基导致之细胞受损。事实上，生体内和生体外研究指出，BC可促进淋巴细胞增殖作用(Hoskinson et al., 1989)及增加助手T细胞数目(Prabhala et al., 1989)。而本试验之淋巴细胞含高浓度BC可能保护或对抗AFB₁经代谢後产生之自由基，此外BC也可能直接调节淋巴细胞之增殖。Chew et al., (1993b)实验发现视觉醇并未随之升高，显示BC有别於一般人认为仅是维生素A原之刻板印象，而是有其独特的作用。

　　虽然AFB₁造成淋巴细胞死亡的确实机制未知，但AFB₁经微粒体酵素代谢之二次产物造成细胞膜不稳定可能扮演一重要地位(Pokrovsky et al., 1972)。曾有报告指出，氧自由基造成细胞膜受损，而致脂质过氧化、蛋白质及DNA之破坏(Perera et al., 1987)。近来研究显示AFB₁及其代谢物可经酵素非酵素作用形成自由基(Kodama et al., 1990)，是否自由基为造成淋巴细胞存活率降低之主因，须加以进一步证实。Lessard and Dupuis (1994)生体试验也陈述日粮中BC含量增加，鸡淋巴细胞增殖作用及自然杀手细胞(natural killer)活性亦提高。但亦有试验指出BC或BC与维生素E协同时无法提高以E. coli免疫鸡只的凝集抗体力价，维生素E或A却可以提高，此可能与BC对疾病保护机制异於维生素E或A有关。

        生体外试验，当添加BC浓度为10^-8M对鼠脾脏淋巴细胞增殖无影响，添加BC10^-5M抑制牛周边血液淋巴细胞之增殖作用(Tjoelker et al., 1988)，此一结果与本试验结果相去甚远，其原因可能为不宣品种动物对BC摄取程度差异及free radical存在与否时造成之影响。此一推论基础可由Lawlor and O'brien (1995)应用paraquat 0.25 mM处理鸡胚纤维母细胞(chicken embryo fibroblast, CEF)18小时，造成其氧化性紧迫，当0.1μM BC添加时，superoxide dimutase及glutathione peroxidase (GSH-px)活性回复至与对照组相同水准，且降低catalase活性。当10μM BC添加时superoxide dimutase及catalase显着升高且GSH-px活性降低至与对照组相当。显示BC有效保护CEF对抗paraquat诱发之氧化性紧迫。

        综观本试验结果显示，高浓度AFB₁ (10⁴ ng/ml)经代谢後对鸭淋巴细胞毒性增强，高浓度胡萝卜素(0.1 μM)可保护鸭淋巴细胞免除此一毒害作用，是否为抑制氧自由基之产生，须进一步探讨。

参考文献

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The Cytotoxic Effect of Aflatoxin B₁ on Duck Lymphocytes and the Protective Effect of β-Carotene

Yeong-Hsiang Cheng⁽¹⁾ and Victor-Fei Pang⁽²⁾

Received Oct. 26, 1995; Accepted Jan. 29, 1996

ABSTRACT

        The purpose of this experiment was to determine duck peripheral blood lymphocyte proliferation by a MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. This assay was also used to evaluate the cytotoxic effect of aflatoxin B₁ (AFB₁) on duck lymphocyte and the protective effect of β-carotene (BC).

        Trial 1: Three mitogens were examined and the results showed that phytohaemagglutinin (PHA) had the best proliferation response, pokeweed mitogen (PWM) intermediate, and Concanavalin A (Con A) the least. Using best-fit regression, the best mitogen concentrations for proliferation response were PHA, 23.68 μg／ml；Con A, 34.48μg／ml and PWM, 23.57 μg／ml, respectively.

        Trial 2: The proliferation response of lymphocyte number by a MTT assay showed a quadratic fashion. When cell numbers were raised from 1×10⁴ to 1×10⁷ cell／ml, the OD values were also increased. However, the OD values tended to decrease when cell numbers were increased to 1×10⁸ cell／ml.

        Trial 3:The results showed that AFB₁ treatment from high dose (1×10⁴ ng／ml) to low dose (1×10¹ ng／ml) had OD values significantly lower (P＜0.05) than PHA treatment alone. But, there was no inhibitory effect when AFB₁ Aat an extremly low dose (1×10^-2 ng／ml) was introduced. High dose of AFB₁ which was metabolized by microsome inhibited lymphocyte proliferation to a greater extent than AFB₁ which was without microsome metabolization. There was no significant inhibition at low dose (1×10¹,1×10^-2 ng／ml) treatments.

        Trial 4: The results showed that when high BC level (0.1μM) was added, OD values of lymphocyte proliferation were higher (P＜0.05) than medium control. Treatment of AFB₁ alone had higher (P＜0.05) proliferation than AFB₁ metabolized by microsome. There was no improvement on lymphocyte proliferation when medium and low levels of BC (0.05, 0.025 μM) were added to culture system of AFB₁ metabolized by microsome. However, when high level of BC was added to the same culture system, the proliferation was higher (P＜0.05) than medium and low levels of BC and the improvement was the same as PHA control group.

        This experiment revealed that high dose of AFB₁ metabolized by microsome had an intensified effect on inhibition of duck lymphocyte proliferation. However, high levels of BC could alleviate this detrimental effect on duck lymphocyte. (Key Words: Duck, Aflatoxin B₁, Lymphocyte, β-Carotene)

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⁽¹⁾Department of Animal Science, National 1-Lan Institute of Agriculture and Technology, I-Lan, Taiwan, R.O.C.

⁽²⁾Department of Veterinary Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan, R.O.C.