抑霉剂与吸附剂对霉菌之影响

郑永祥

一、前   言：

        霉菌可依其生活习性，区分为田间霉菌及仓贮霉菌两类。饲料或谷物在进入仓库储存时，若湿度高时，易使霉菌发芽增殖，造成热的产生与发霉，继而使饲料结块、变色或发黑，并产生霉菌毒素。谷物所寄生的霉菌是属於丝状菌(Filaments fungi)，可分为Mucor，Rhizapus，Aspergillus，Penicillum及Fusarium等五大类，其中以黄麴菌(Aspergillus flavus)所产生的毒素──黄麴毒素(Aflatoxins)对家畜禽的危害最大，不但影响动物之生长与生产，且被公认为致癌物质。

        世界各国对麴毒素在动物饲料中分别订有不同之标准。欧洲市场对混合饲料中黄麴毒素B₁限量10～50ppb；乳牛饲料20ppb，日本对花生粕中黄麴毒素B₁限量为1000ppb，并限制其使用量。以色列则建议所有饲料均须在20ppb以下。美国则以饲料中含量20ppb为行政管理指标(Administrative guideline)。

二、各种抑霉剂之抗霉效果

        抑霉剂在饲料或谷物上之使用；主依其酸性所致 ，而在抑霉剂之酸性特性上，最有效为Intact form即质子化型式(Protonated form)，而离子化(Ionic form)或盐类(Salt form)其抑霉效果即较前者为差。良好之抑霉剂须具备以下四个条件：

        1.经济、便宜     2.无腐蚀性    3.低毒性    4.具有良好之抑霉效果。常被利用的有丙酸及其盐类、醋酸、苯甲酸、山梨酸或清凉茶酸(Sorbic acid)，硫酸铜、龙胆紫。

        Paster (1980)以鸡饲料中添加丙酸钙0.5％及丙酸0.3％，并维持饲料含水量在11.5～13％间，以饲料中二氧化碳产生量之高低，做为抑霉剂有效性之指标。此乃因霉菌可利用饲料或谷物中之碳水化合物将之粕酵产生二氧化碳、热及水的特性。结果0.3％丙酸添加组之抑霉效果达47日之久，较0.5％丙酸盐添加组的12日，多了35日。由於丙酸其酸性强、危险性较大，使用操作时须特别小心，且其对金属如饲料混合加工器械造成腐蚀，臭味亦是其缺点之一。故以丙酸盐来添加，使用上较为安全，其一般以碳酸钙化为携带剂，但抑霉作用远逊於丙酸。

        采取试验期间饲料样品，测其霉菌菌相，结果以Aspergillus candidus为最多，而Aspergillus flavus则较少，由此可推知其含黄麴毒素浓度不高。饲料之相对湿度於75～95％时产热主由霉菌而来，当相对湿度95％以上时主为细菌而来。试验期相对湿度维持於80～85％，故其热之产生主为霉菌所造成；当温度提高，伴随二氧化碳升高及霉菌数增加。

        抗霉剂在液体培养基中之作用，是否一如在饲料中；此一乾性基质。Stewart等(1978)以2％酵母萃取物加上4％葡萄糖於26℃培养10日，在培养前分别加入Aspergillus parasiticus NRRL 2999及各种抗霉剂。如：丙酸及其Na，Ca盐，龙胆紫，硫酸铜。结果发现丙酸及龙胆紫抑霉效果最佳。Dixon等(1981)以玉米粉为基质添加2％苯酸及清凉茶酸，将之置入锥形瓶中以29℃培养48小时，另外两组为液体4％的醋酸及丙酸。以管中CO₂形成量经气相层析仪分析，作为抗霉效果的指标。当玉米粉中含20％水分时，以丙酸及苯酸之抗霉效果最佳。当水分维持35％时则以丙酸及青凉茶酸为最佳。由此可知丙酸的效果。一般而言，基质中所含水分量较高者，须获得一定程度之抑霉作用时，抑制剂浓度须较高。

        饲料或谷物若己发霉时；添加防霉剂时对饲料之营养价值或结果是否有改善作用。由於发霉玉米其脂肪含量下降约2.2～3.9％，故其代谢能会下降。若日粮中添加油脂时是否有节约发霉玉米的效果。Bartox (1983)以日粮中有无发霉玉米及有无油脂添加(大豆油1.1％)及防霉剂丙酸或硫酸铜添加对一日龄～三周龄之哈巴公鸡作试验。结果，发现发霉玉米之日粮其营养价值可经由应用大豆油之添加之抑霉剂──丙酸之使用而改善。防霉剂除上述介绍外，另外龙胆紫在畜产饲料之使用亦有之，但在水产饲料则忌讳，因其水中会呈现出蓝紫色。Hall等(1981)测试龙胆紫於液态培养基中的抗霉效果，发现龙胆紫浓度於4μg／ml可使Aspergillus parasiticus霉菌芽胞生长被抑制。

粒状料

粉　料

粒状料

粉　料

粒状料

粉　料

粒状料

－

＋

＋

＋

＋

＋

＋

－

－

－

CP

CP

AG

AG

110

1775

253

1030

170

820

200

2.9

1.9

2.4

2.0

2.5

2.4

2.6

12.8

17.5

16.0

18.3

16.4

16.4

16.1

400

10.000

4.500

10.000

200

5.600

4.600

3.3

1.8

2.8

2.1

2.9

2.5

2.8

13.7

19.3**

16.1

19.2**

17.0

17.0

16.2

*代表显着性(＜.01)

Paster等(1985)以丙酸钙与商业性防霉剂──Agrosil(主成分丙酸再加入四种酸所组成)测试在粉料
(mash meal)及粒状料(pellet meal)之防霉效果，结果如表1所示。粒状料较分料在贮藏6日後霉菌数
减少约10倍，而添加水时，霉菌数增加。粉料＋水＋Agrosil较粉料＋水＋丙酸钙之抑霉效果佳
(820 vs 1030)，但在粒状料时反之(170 vs 200)。可能为饲料在打粒过程中，破坏其中Agrosil之
活力所致。

三、影响抗霉菌剂作用之因素

1.粒子大小：

        影响抗霉菌剂作用之因素除抗霉剂选择(Antifungal agent)及抗霉剂之浓度；使用何种霉菌菌株为指标(Indicator Microorganism)。明显地；在抑霉菌之前理论上及实际上；抑制剂须与霉菌直接接触。仅添加抗霉菌剂到饲料中并不够；抗霉菌剂必须在饲料中均匀的分布以便其与霉菌接触，而饲料之粗细程度理论上应较抗霉菌剂粗细程度，对抗霉效果之产生影响为大。

        Dixon et al, 1981即应用玉米粉为基质；添加0，0.125，0.5，1.0，2.0(mg／g)propionic acid以观察饲料粒子大小对抗霉剂作用之影响。Corn meal之粒子分四级，＜0.15mm，0.59～0.83mm，1.41～1.65mm，＞2.36mm。Corn meal＋propionic acid加入培养瓶中(10×150mm)＋Septa再抽取其内CO₂浓度以GC测定之。其结果示於图1：

        抑霉剂之效果随粒子变小而变佳；此因粒子小；则Propionic acid可以更均匀分散；而利於抑霉作用之进行。

        接着应用含水量35％之玉米粉为基质，当随着粒子变小其CO₂产生之浓度下降。其抗霉效果为：＜0.15mm＞0.59～0.83mm＞1.41～1.65mm＞2.36mm。如图2所示。

2.水分含量：

        饲料或谷物中之水分含量直接影响到饲料或谷物中霉菌之发育繁殖。

        Dexon et al (1981)以白肉鸡前期料及Cornｍ meal为基质。分别加入不同量之合成抗霉剂Mold-X；其成分为含4种酸之混合并以CaCO₃为赋形剂。

        其结果示於图3及图4。随水分含量之增加；抗霉剂使用须达到一定之抗霉效果时，抗霉剂量必须提高；如以最小抑制浓度MIC (Minimum Inhibition Concentration)在20％ H₂O处理组时Mold-X为0.125 mg／g，而25％ H₂O时0.5 mg／g；35％ H₂O处理组时MIC为1.0 mg／g。

        作者提及测定霉菌生长的指标，其方法有(1)Glucosamine──细胞壁组成分。(2)热之产生。(3)CO₂之产生，(4)毒素之产生；其中以CO₂之产生为代表霉菌呼吸作用之结果，乃为初期代谢产物；易於准确而容易测定。

        Dixon et al另外应用Corn meal为基质以测定不同水分含量20％，25％，35％水分下Mold-X之抗霉效果。与图3比较，图4中CO₂的产生量较高，表示Corn meal中所含之碳水化合物有利於霉菌之生殖与发育。其MIC在20％ H₂O为0.125 mg／g；25％ H₂O时为0.25 mg／g；35％ H₂O时为0.5 mg／g；显示含水量之提高；使得饲料易於结块(Caking)不易於Mold-X添加时之搅拌均匀。

3.单位原料对抗霉作用之影响：

        Dixon et al, 1981由上述之实验发现Corn meal对Mold-X之抑霉作用有拮抗作用(antagonisis)；而白肉鸡前期饲料之拮抗较小。作者於是利用各种单位原料，大豆粕，家禽副产粉，及鱼粉(fish meal)，脂肪为基质，其中以Corn meal将之稀释成各种不同百分比；测试Propionic acid之抗霉作用是否受上述单位原料所影响，其结果示於图5。

        当大豆粉逐渐由10％增加至50％时；渐显出拮抗效果；鱼粉之添加及玉米筋粉(Corn gluten meal)之添加亦有相同之拮抗效果；而图6之家禽副产粉(poulty by-product)亦有拮抗作用；其为何有此一结果；作者解释为丙酸的游离酸形式被转变成为较不具有活性之盐类形式(Salt form)，藉由饲料组成分中的缓冲效果(Buffering effect)有关；举凡鱼粉(fish meal)，大豆粉、Poulty by-product meal均为富含蛋白质之饲料原料；因蛋白质为胺基酸所组成；胺基酸为一双极性物质；以Zwitterion存在；所以为一良好缓冲物质(Lehinger, 1975)，但更可能之解释为Corn gluten meal其硷性胺基酸(basic amino acid)含量少：诸如Lysine，Arginine较少故缺乏中和酸之能力。

        当脂肪添加於玉米粉(Corn meal)时，可增加丙酸之抗霉效果；脂肪具有此一协同作用(Synergenetic effect)可以解释为；增加液态丙酸(liquid form)之分散(distribution)，抗霉剂之活力(activity)受饲料组成所影响；此对於饲料单位原料选用及使用量上具有参考价值。请参阅图7。

四、吸附剂对Aflatoxin之吸附作用

        黄麴毒素不易被破坏，故打粒及加工对其影响少，且其不具抗原性(antigenicity)，故无法经由免疫进行而达到预防之效果。而污染含黄麴毒素之饲料；利用或将之抛弃有无数的困难及严重的经济问题。现今仍无任何可靠而足以实际应用之方法；而须经由避免或进行Aflatoxin之移除。较经济而可行之方法；乃发展一无毒之日粮添加物减毒物质；可使家禽或动物对其更具有抵抗力；例如日粮含高量的脂肪；或蛋白质、金霉素(Aureomycin)、抗生素(Antibiotics)或维他命混合给予之日粮；加以减低Aflatoxin的毒性作用；亦可利用吸附剂(Absorbent)以减少Aflatoxin在生体内之吸收。

        Phillip et al (1988)使用三种吸附剂作为评估其在液体容器中吸收Aflatoxin之百分率；其中以矽酸铝(Aluminum silicate)之吸附能力较明矾(Aluminas)及矽酸(Silicate)为佳。AFB₁吸收99％对29％ and 82％。而後作者利用饲料添加Aflatoxin B₁ 75mg／kg及0.5％ Hydrated Sodium Calcium Aluminosilicate (HSCAS)以Hyline W-36之公来航 作为期0～4wks试验；另以Hubard×Hubard公肉鸡进行0～3wks龄之试验；其结果示於图8；由表中可知0.5％ HACAS之添加具有保护鸡只免受AFB₁之毒害作用；HSCAS为具有多孔质之物质；对Aflatoxin具有强力之亲和性(Affinity)。在来航鸡之效果较白肉鸡之效果为佳。HSCAS经与Affatoxin结合後降低其在生体内之生物可利用性(bioavailability in vivo)。    

        饲与0.5％ HSCAS及Aflatoxin之鸡只肝脏与单独喂与7.5 mg／kg AFB₁之鸡只肝脏比较时可见；AFB₁喂饲组肝脏明显地较胆弱(Friable)及苍白。而添加0.5％ HSCAS肝脏则红润趋於正常。

        因此此一抗结块剂及其他同种之aluminosilicate证实在预防黄麴毒素的(Aflatoxicosis)之管理上；相当有效。

        Dalvi等人於1984应用活性炭(Active charcoal)；为吸附剂；且应用水中添加0.05％Reduced glutattione还原态之麸胺酸及0.05％ Phenobarbital。

        以Hubard×Hubard种肉鸡0～4wks龄为试验期5～8wks日粮中采未添加药物前期料。再以10ppm AFB₁对鸡只加以攻毒。测试上述药物对鸡只的保护作用。

        饮水中添加之Phenobarbital为一种麻醉剂；当鸡只或动物食入後可以使得肝脏中微粒体混合功能氧化鶤系统(Microsomal mixed Function Oxidase System, MFO)中Cytochrome P-450之活性提高25倍(25-fold)；而cytochrome P-450具有加氧作用(Monooxygenase)；在动物体去毒机构(detoxification mechanism)中扮演phase Ｉ，第一期的作用；即在AFB₁鶭喃环(Furan ring)中8.9碳双键上加入氧；形成Aflatoxin B₁ - 8,9 - oxide。其作用径路(Pathway)示於图9。

        在表2中可知当AFB₁ 10 ppm添加时cytochrome P-450活性及Benphetamine   tabolism以每分钟，每克微粒体蛋白质所产生之甲醛量，Benphetamine为一种药物可经由肝代谢成为甲醛(formaldehyde)，但当AFB₁ 10 ppm加入时造成肝脏受损使其在肝中代谢速率下降；而SGOT (Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase)活力因肝脏被破坏；造成细胞膜破裂或渗透性增加使原存於细胞质中之SGOT自肝中流入血中，故其可为肝脏疾患之指标。

当饮水中添加GSH；或饲料中添加Activated charcoal时细胞色素P-450增加表示detoxification进行加速；且Benzphetamine代谢量增加；SGOT稍降；显示其具有保护功能。而phenobarbital添加饮水时；cytochrome P-450显着较其他各组为高(P＜0.05)显示其具有Induce作用。

        GSH之结构乃为三种胺基酸所组成为强之还原剂；可提供H⁺给epoxideo使之经由cytochrome P-450代谢AFB₁而来之AFB₁ - 8,9 - oxide形成羟化物(hydroxylation之 GSH-AFB₁之无毒性)物质；且呈水溶性；易於排出体外，图10，11所示。

        Cytochrome P-450另可代谢AFB₁成为AFO₁为毒性较弱之化合物；且经由P-448代谢为AFM₁；毒性亦弱，如图12示。