应用酵素结合免疫吸附测同法，检测肉猪血清、尿液
及饲料中磺胺二甲嘧啶残留量操作技术
一、测试原理
磺胺二甲嘧啶直接式酵素结合免疫吸附测定法(SMT One-Step ELISA)系依据固相免疫分析技术(solid phase immunoassay technology)，以微量测试孔(Microtiter well)当做固相物之检测试验，即於微量测试孔内涂附有对SMT具高度亲和性之单源抗体(monoclonal antibody)，此抗体仅能和SMT产生结合反应。每一微量测试孔条(Microtiter well strips)系由12个测试孔组成，操作时第一孔为阴性对照液，第二孔为已知SMT浓度之阳性对照液，其馀各孔为待测样品检液。当各孔中都加入SMT酵素结合体後，它就会与阳性对照液及待测样品检液竞争孔内阳性对照液间之颜色比较来测知该样品SMT之含量。颜色愈深表示含药量愈少，反之则愈高。反应结果以肉眼比色做初步判定或以酵素免疫分析阅读仪(EIA reader)做正确判定和半定量。
二、测试器材
(一)高速酵素免疫分析阅读仪(Enzyme Immunoassay Reader, EIA Reader)仪器规格性能详如下列：
体 重：8.0"×10.0"×2.3" (200×250×60mm)
重 量：71bs (3.2Kg)
输入方式：双色高等速
输入容量：12架、96管
每次扫描最多可读20管
资料控制：光学感应条码
输 出：20行热感式印表机RS232C，1200band
精 密 度：同次扫描误差度1％
每次扫描误差度2％
波 长：双重固定干扰滤光镜，650mm & 450mm
电 压：100-220VAC
品 名：ULTRASCAN CLINICAL ANALYZER
型 号：UI-001
制造商：SPECIALTY MEDICAL INDUSTRIES INC. U. S. A.
仪器操作说明详见附录(一)
(二)磺胺二甲嘧啶酵素免疫微量测试孔试剂套组(SMT Microtiter well test kit)〔注1〕
此套组包括：
1.微量测试孔(Microtiter well)，8 strips／盒，12wells／strip；涂附磺胺二甲嘧啶抗体。
2.磺胺二甲嘧啶酵素结合体(SMT-Enzyme)1瓶，容量12ml。
3.受鶤质A (Substrate A)1瓶，容量10ml。
4.受鶤质B (Substrate B)1瓶，容量10ml。
5.清洗液2瓶，容量125ml／瓶。
6.稀释液4瓶，容量125ml／瓶。
制造商：INTERNATIONAL DIAGNOSTIC SYSTEMS CORP
(三)其它必备器材：
离心机、均质机、均质瓶、定量分注器、微量自动吸管(12孔及单孔)、吸管尖头、洗涤瓶、定量瓶、注射筒、采血针、烧杯、吸管、滤纸、漏斗、试管、试管架、甲醇、磺胺二甲嘧啶标准品及猪只保定器等。
三、标准液之配制
(一)精确秤取25mg磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine, SMT)标准品置於定量瓶中，以甲醇溶解并定量至25ml，其浓度为1,000μg／ml当作原液。
(二)吸取原液0.1ml置於定量瓶中，以磺胺二甲嘧啶酵素免疫微量测试孔试剂套组(SMT Microtiter well test kit)中之Dilution Butter稀释定量至100ml，其浓度为1μg／ml当做标准液。
(三)取标准液0.1ml置於定量瓶中，再以Dilution Buffer定量至100ml，其浓度为0.001μg／ml当作空白检液取得试验之阳性对照液。
四、检液之制备
(一)血 清：
颈静 采血约5ml注入试管中静置，俟凝固後再离心分离(2,000 rpm，10分钟)，取上清液0.2ml置於试管中加入1.8ml Dilution Buffer，振荡混合後即为10倍稀释之检液。
(二)尿 液：
收集尿液约5ml置於试管中离心分离，取上清液0.1ml置於试管中加入2.9ml Dilution Buffer，振荡混合物即为30倍稀释之检液。
(三)饲 料：
秤取50g饲料置於均质瓶中，加入80％甲醇溶液100ml後均质3分钟，以滤纸(Whatman NO. 4)过滤，取滤液0.1ml置於试管中加入4.9ml Dilution Buffer，振荡混合後即为100倍稀释之检液。
五、空白检液之取得
方法Ⅰ：依照本法所述之检液制备与测试步骤，共以高速酵素免疫分析阅读仪检测其吸光值，选取高於阳性对照液吸光值的样品液当作空白检液。
方法Ⅱ：采用化学方法进行样品萃取後，再以TLC法做定性分析确认无SMT残留者，该样品检液可当做空白检液。
六、阳性对照检液之配制〔注2〕
(一)血清试验：
取经10倍稀释之空白血清检液4.9ml置於试管中，再加入0.1ml SMT标准液(浓度1μg／ml)，振荡混合後即为阳性对照检液，其SMT含量为0.02μg／ml。
(二)尿液试验：
取经30倍稀释之空白尿液检液4.9ml置於试管中，再加入0.1ml SMT标准液(浓度1μg／ml)，振荡混合後即为阳性对照检液，其SMT含量为0.02μg／ml。
(三)饲料试验：
取经100倍稀释之空白饲料检液9.8ml置於试管中，再加入0.2ml SMT标准液(浓度1μg／ml)，振荡混合後即为阳性对照检液，其SMT含量为0.02μg／ml。
七、测试步骤〔注3－5〕
(一)将微量测试孔条嵌入固定盘架并置於台面白纸上，以附提把之测试孔为起点，依序将对照检液及待测样品检液号码注明於该纸上。
(二)於第一孔内注入空白样品(血清、尿液或饲料)检液20ul，当作阴性对照液。
(三)於第二孔内注入阳性对照检液20ul。
(四)於其馀各孔内分别注入待测样品检液20ul。
(五)每孔内均加入磺胺二甲嘧啶酵素结合体100ul，轻轻振荡混合。
(六)於室温下反应20分钟。
(七)以清洗液冲洗各孔至少3次，倒弃清洗液并敲乾。
(八)每孔内均加入受鶤质混合液150ul。
(九)於室温下反应10分钟。
(十)使用高速酵素免疫分析阅读仪以波长650nm扫描判读。
八、结果判定
(一)若样品检液之吸光值大於阳性对照检液时，则表示该样品中SMT之含量小於阳性对照检液中SMT之浓度。〔注6〕
(二)反之若样品检液之吸光值小於或等於阳性对照检液时，则表示该样品中SMT之含量大於或等於阳性对照检液中SMT之浓度。
(三)依据猪血清、尿液与肌肉中SMT残留量关系系数〔注7〕加以推算，当血清中SMT含量为0.2ug／ml；尿液中为0.6ug／ml时，则肌肉中SMT残留量为0.05PPM。若以此值为筛选判定基准则前述样品吸光值大於阳性对照检液时判为阴性或合格，反之小於或等於阳性对照检液时判为阳性或不合格。〔注8－9〕
注 解
1.微量测试孔试剂套组应於冰箱冷藏(4～8℃)保存，禁忌冻结，有效使用期限为六个月。
2.阳性对照检液不宜长久保存重复使用，应於每次试验前重新配制以免影响判定结果。
3.测定孔及试剂应於每次试验操作前自冰箱取出并放置室温约1小时使各试剂均达室温(23～29℃)，注意勿让试剂过热(超过35℃)，微量测试孔条取出量亦应视测试样品量之多寡而定，不需全部取出且测试孔条只能使用一次。试剂中均添加有抗生物质当作防腐剂，具危险性，应避免接触皮肤，若不慎触及亦应立即以清水冲洗。
4.受鶤质混合液应视实际需要量，於每次试验前以受鶤质A液及B液等量混合後随即使用，配制时应注意使用不同吸管尖头以避免交叉污染，新配制混合液正常为无色透明，但久置後会变蓝色故不宜保存使用。
5.进行空白样品检液之取得试验时，除测试步骤2改以Dilution Buffer当做阴性对照，步骤3.改以SMT标准液(浓度为0.001μg／ml)当做阳性对照液外，其馀步骤不变。
6.阳性对照检液中SMT之浓度，血清、尿液和饲料均为0.02μg／ml，经分别乘以稀释倍数，则实际含量血清为0.2μg／ml，尿液为0.6μg／ml，饲料为2μg／g。
7.根据美国农业部食品安全检验署(FSIS，USDA) VICTOR W. RANDECKER等五名专家发表於JOURNAL OF FOOD PROTECTION, 1987，50，P.115～122试验报告有关猪只血清、尿液与肌肉中SMT残留量关系之结论如下：
肌肉中SMT残留量(ppm)＝血清中SMT残留浓度×0.24
肌肉中SMT残留量(ppm)＝血清中SMT残留浓度×0.08
换言之即血清浓度为肌肉之4.2倍，尿液浓度为肌肉之12.5倍。
8.若肌肉中SMT残留量以0.1ppm为筛选判定基准则血清试验中阳性对照检液SMT之实际含量应为0.4μg／ml，尿液试验中阳性对照检液SMT之实际含量应为1.2μg／ml。
9.每次检测操作必需同时要有阴性和阳性对照各一，并应使用不同之吸管尖头吸取检液，以免因彼此相互污染而影响判定结果，为确认本试验结果之正确性，阴性对照(第一孔)应呈显着蓝色反应。
饲料中磺胺二甲嘧啶酵素结合免疫吸附测定法(SMT ELISA)操作流程：
(1)样品萃取
饲料(10g)
80％甲醇溶液20ml
振荡器水平振荡10分钟
离心分离(2000rpm，5分钟)
上清液
(2)检液配制
取上清液0.1ml加入4.9ml，Dilution buffer於试管中振荡混匀即成100倍稀释样品检液。
(3)阳性对照液配制
(A)饲料加药0.2ppm：秤取10g空白饲料添加200ul磺胺二甲嘧啶标准液(10μg／ml)。
(B)饲料加药0.2ppm：秤取10g空白饲料添加200ul磺胺二甲嘧啶标准液(100μg／ml)。
加药饲料依上述样品萃取和检液配制成阳性对照液(A) & (B)。
(4)测试步骤
1将微量测试孔条嵌入固定盘架上。
2.第一孔内注入阳性对照液(A) 20ul。
3.第二孔内注入阳性对照液(B) 20ul。
4.其馀各孔内分别注入待测样品检液20ul。
5.加入磺胺二甲嘧啶醇素结合液100ul。
6.室温反应20分钟。
7.使用清洗器以清洗液冲洗至少3次後吸乾。
8.加入受鶤质混合液150ul。
9.室温反应10分钟。
10.以波长650nm之EIA reader判读。
(5)判 定
1.当样品吸光值大於饲料加药0.2ppm时，判为ND(未验出)。
2.当样品吸光值大於饲料加药0.2ppm但小於加药0.2ppm时，判为SMT＜2.0ppm。
3.当样品吸光值小於饲料加药2.0ppm时，判为SMT＞2.0ppm。
附 注：
1.本法设定磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine；SMT)最低检测感度0.2ppm。
2空白饲料之检出：
(1)采用本测法选取吸光值大於Dilution buffer之样品当做空白饲料。
(2)采用化学方法进行样品萃取後，再以TLC法做定性分析，确认无SMT残留者，可当做空白饲料样品。
附录一 高速酵素免疫分析阅读仪操作说明
Ⅰ、操作说明
酵素免疫测量仪是一种智慧设计之光学分光仪器，专为读取酵素免疫试剂测量及医疗检验测试之测量值。它读取所有通过仪器顶部的测光孔之试管或微量测试孔的浓度。条码附在酵素免疫测量仪附件之微量测试孔盛放架内以控制检测程式及数据归纳与整理。此结果很快便可列印出来。
Ⅱ、输入原理
酵素免疫测量仪快速的读取样品的吸光值，光源由灯光发出後经修正为两道光束，每道光束被滤镜吸收後再由不同的光学感应器收集，条码选择检测所需之波长作数据的归纳整理。酵素免疫测量仪拥有专利号码US PATENT 4,729,661。光束逐次通过试管并由内设的两部微处理器记录结果，此种逐次测试可避免试管或微测试孔内产生误差的影响。
样品经由双色吸光法测量，但准确度较差，测量状态及波长会印在结果报告上。用双色比较吸光测量法，第一次及第二次的检测结果会有差异，可经由选择校正。
Ⅲ、条 码
条码是操作本仪器的钥匙，条码可避免样品测量时的误差并作立即更新。条码输入与样品测量同时进行，条码可输入下列资料：
1.检验名称 6.单 位
2.数据归纳方法 7.标准值浓度
3.控制组数量 8.波 长
4.读取模式 9.间次测量间隔时间
5.结果输出格式
条码是塑胶片模式供应，每一种测试有特定之条码，均勿在操作中更换条码。
Ⅳ、架 子
本仪器可配用不同的架子，每种可盛装样品及条码。条码以固定之方向填装入架子的底部。试管架一次可盛装12支试管，试管可从架子上方放入，放入试管时稍微旋以便试管之插入，架子设计为试管开口向上之插入状态。试管插入後放於平坦桌面并向下压以使试管齐平。某些试管有不同之半径规格而试管架只适合一种半径规格以避免造成不同吸光值的误差。
微测量孔置放架可容纳一条12孔的微测量孔，微测量孔以开口向上之方向置入於架子底部的较大凹槽内，插入後置放於平坦桌面并向下压以使其齐平。某些微测量孔可以按照需求量折开使用於本仪器内测量。
Ⅴ、操作流程：
1.开启电源，仪器印出：ULTRASCAN READY READ ASSAY NOW？
2.按下YES开始测试或按下NO选择特殊功能。
3.置放待测样品及条码。
4.按下YES後仪器印出：LAMP WARMUP…………
5.10秒後印出：READY：PUSH NO TO END
6.将测试架放入测量槽并向前滑动开始测试。
7.测完後仪器发出哔哔声，以相同方法测量其馀样品。
8.所有样品均测完後按下NO，即将结果印出备用。
本仪器次循环可测试96个样品。每一次测完後如没有下一步指示，则经过一分钟後仪器自动印出：TIME EXPIRED.如果按下NO自动印出结果报告。
附录二 食用畜肉类卫生标准
76.2.21 卫署食字第647195号公告
| 类别＼项目 | 性 状 | 每 公 克 中生 菌 数 | 每百公克中挥发性盐基态氮 | 磺 胺 剂残 留 量 |
鲜 肉 |
应具有各种肉类良好风味色泽，不得有腐败、不良变色、异臭、异味、污染或含有异物、寄生 或其他异状 | 三千万以下 | 20mg以下 | 0.1ppm以下 |
| 注：冷冻肉并应符合冷冻食品类卫生标准之规定。 | ||||
附录三 动物用药残留标准
76.4.11 卫署食字第658449号公告动物用药残留标准
| 药 品 名 称 | 禽 畜 种 类 | 残 留 部 位 | 残留标准(ppm) |
| 氯啶(Clopidol) | 猪。 牛、绵羊、山羊。 牛、绵羊、山羊。 牛、绵羊、山羊。 鸡、火鸡。 鸡、火鸡。 乳牛、山羊。 |
可食部分 肌肉 肝 肾 肌肉 肝 乳 |
0.2 0.2 1.5 3 5 15 0.02 |
| 富来顿(Furazolidone) | 猪、鸡、火鸡。 | 可食部分 | 0 |
| 硝化富乐逊(Nitrofurazone) | 猪、鸡、火鸡。 | 可食部分 | 0 |
| 滴克奎诺(Decoquinate) | 牛、鸡。 牛、鸡。 |
肌肉 肝，肾 |
1 2 |
| 孟宁素(Monensin) | 牛、鸡。 | 可食部分 | 0.05 |
| 卡巴得(Carbadox) | 猪。 | 可食部分 | 0.03 |
| 罗苯嘧啶(Robenidine)Hydrochloride | 鸡。 鸡。 |
可食皮、脂 其他可食部分 |
0.2 0.1 |
| 磺胺剂(Sulfadrugs) | 牛、小牛、猪、鸡、火鸡。 鸡、鸭、鹌鹑。 乳牛、山羊。 |
可食部分 蛋 乳 |
0.1 0.1 0.01 |
| 配尼西林(Penicillin) | 牛、小牛。 火鸡。 猪、鸡、雉、鹌鹑、绵羊。 |
可食部分 可食部分 可食部分 |
0 0 0 |
| 链霉素(Streptomycin) | 猪、鸡、火鸡。 | 可食部分 | 0 |
| 四环素(Tetracycline) | 小牛、绵羊、山羊、猪、鸡、火鸡。 | 可食部分 | 0.25 |
| 泰霉素(Tylosin) | 牛、小牛、猪、鸡、火鸡。 鸡、鸭。 乳牛。 |
可食部分 蛋 乳 |
0.2 0.2 0.05 |
| 红霉素(Erythromycin) | 猪。 鸡、火鸡。 鸡。 牛。 乳牛、山羊。 |
可食部分 可食部分 蛋 可食部分 乳 |
0.1 0.125 0.025 0 0 |
| 新霉素(Neomycin) | 小牛。 乳牛、山羊。 |
可食部分 乳 |
0.25 0.15 |
| 健它徽素(Gentamicin sulfate) | 火鸡。 猪。 猪。 猪。 |
可食部分 肌肉 肝 脂、肾 |
0.1 0.1 0.3 0.4 |
| 林可霉素(Lincomycin) | 猪、鸡。 乳牛、山羊。 |
可食部分 乳 |
0.1 0.15 |
| 羟四环素(Oxytetracycline) | 牛、猪。 鸡、火鸡。 鸡、火鸡。 |
可食部分 可食部分 肾 |
0.1 1 3 |
| 氯四环素(Chlortetracycline) | 牛、未泌乳之乳牛。 牛、未泌乳之乳牛。 小牛、猪。 猪。 猪。 小牛。 猪。 小牛 。 乳牛、山羊。 绵羊。 绵羊。 绵羊。 鸡、火鸡、鸭。 鸡、火鸡、鸭。 |
肌肉、肝、肾 脂 肌肉 肝 肾 脂 脂 肝、肾 乳 肌肉 肾 肝 可食部分 蛋 |
0.1 0 1 2 4 1 0.2 4 0 0.1 1 0.05 1 0 |
| 已烯雌酚 (Diethylstilbestrol) |
牛、绵羊、山羊、鸡 | 肌肉、肝 | 0 |
| 注：本表未列者，不得检出。 | |||
附录四 肉品中残留药物限量标准
76.9.8卫署食字第683805号
| 残 留 药 物 | 限 量(ppm) | 备 注 |
| 滴 滴 涕 (DDT) | 5 | 1.本标准未列者，不得检出。 2.残留药物均包括其衍生物。 3.脂肪基准。 |
| 地特灵及阿特灵 (Dieldrin & Aldrin) | 0.2 | |
| 飞 布 达 (Heptachlor) | 0.2 |
资料来源：台湾养猪科学研究所
饲料营养杂志(19~32)－郑幸祥．九一年四期
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