动物胚和精子之性别鉴定技术

如何能很迅速地一次分离足够正常人工授精的精子数目，而且不损及其精子活力和型态，更不影响其授精後的生育能力，此为往後分离精子必须改进努力的目标。

各种动物因性别之不同而其生理解剖上亦有所差异，因此在饲养上和市场的价格上的经济收益差异也很大。在理论上动物公母之性比例约在 1：1，所以在自然状况下之性比例也只有公母各半的机率。

近二十年来有关动物性别的控制技术已有相当程度的进展，其中如利用体外授精，核移置和细胞融合技术之发展已可获得正常怀孕和分娩仔猪的报告，因体外授精、核移置和细胞融合技术之发展则大量增加了胚胎的来源，则胚胎之性别控制上可应用细胞学的方法或胚胎显微分切来检定性染色体，在胚胎分裂发育至适合於移置时给予性别鉴定始再行移置，但是，因使用染色体以检定性别的检出率低，检定的时间长，往往也因胚胎难免受损而使移置後其受胎率降低。

其他性别鉴定的方法如 H Y 抗原已证实可应用在牛、绵羊和猪等家畜，使用此项技术在胚胎性别鉴定的准确率分别为 77 88% 和 82 89%，正确性相当高。此项技术应用在牛胚胎或单胎动物胚胎上有其实质上的经济效果，但如应用在猪胚胎，因其性别准确率不如单胎动物，所以其经济效益上无法与单胎动物相抗衡。

在性别控制技术上另一种方法是精子中具有 X 和 Y 染色体的分离。在人类和实验动物方面已有相当程度的成功率，但是利用这些技术应用在家畜的精子分离，则因参与的动物头数不多或未能重复试验致使缺乏说服力。近几年来使用精子来控制性别比较有理论根据的学者有美国农业部的 Dr. Johnson 等人，( 1989；1991 )。他们以测定脱氧核甘酸 ( DNA ) 含量多寡的方法来判定其性别。其过程为将精子置入流动测定仪 ( Folw Cytometer ) 分离含有 X 染色体和 Y 染色体的精子。并已将分离的兔和猪精子经由输卵管授精法获得生产特定性别之动物，此方法也是迄今为止分离精子性别比较精准的方法。

此方法为抽取胚胎内的细胞经过适当的培养後在辨别 X 或 Y 染色体。因此方法抽取胚胎内的细胞时有损及胚胎之存活，致使经移置後其成功率很低。

从 5.75 天囊胚期胚胎抽取 200 ~ 300 个滋养外胚层细胞 ( Strophectodermal cells )，将细胞固定和染色後鉴定 Barr body 的存在与否来判定其性别。用此方法鉴定性别有很高的精准率，但是胚胎的存活率却很低 ( 16.5% )。

将 12 ~ 14 天之孵化囊胚期胚胎抽取 0.5 mm^² 之滋养外胚层细胞，组织切片细胞给予适当培养後，使用核型鉴定方法来判定其性别，经移置其受胎率很低 ( 38% )。

将 6 ~ 8 天孵化前之胚胎抽取少许滋养外胚层细胞组织切片，经适当培养後，再用核型鉴定方法来判定其性染色体。因此方法鉴定性别有 59% 的胚可以判定性别，但其分娩後仔畜性别之正确率仅 33%。

将 6 ~ 7 天的胚胎分切成两半，经体外适当的培养後，使用核型鉴定方法来判定性染色体。以此方法鉴定性别有 60% 之半切胚可被鉴定性别。

以雌胚比雄胚生产较多之 X Linked 酵素的特性来判别 X 或 Y 胚之方法。用此方法有 64% 之准确率。

H Y 抗原为雄胚特有之蛋白质，经萤光染色後可以进行性别鉴定。由於方法不需要抽离细胞，而且在萤光照射下的时间也很短 ( 无伤害 )，经移置後其受胎率不受影响。此方法鉴定性别可达 80% 的准确率。

利用雄性特有之 Y 染色体基因探针可检测出 57% 之细胞组织，其性别检测的准确率可高达 95%。因此方法必须抽取细胞检测，胚受损率高，致使影响移置後的受胎率很大。近年来国外正尝试利用 Polymeric Chain Reaction ( PRC ) 技术企图尽量减低对胚胎的伤害程度以便提高移置的受胎率。但此方法必须与仪器配合，故想见其花费的费用极为昂贵。

因人类 X 和 Y 精子的大小和比重上有差异，所以经此方法可以分离试验动物和人类 X 和 Y 精子。1982 年 Beernnink and Ericsson 曾经使用此技术成功地分离人 X 和 Y 精子。但是利用此技术分离牛的 X 和 Y 精子，并将分离之精子给予授精、分娩，出生之仔畜性别则无明显的差异。

利用雄性动物细胞表面持有特别之蛋白质 ( H Y 抗原 )。并以免疫之方法生产 H Y 抗体血清，在配合萤光染色技术可以辨别 X 和 Y 精子。利用此技术分离鼠和兔子 X 和 Y 精子则可获得相当程度的性别改变 ( 母鼠 54.6%；母兔 63% )。

利用 Flow Cytometric 仪测定哺乳动物精子 DNA 含量已有报告 ( Garner et al., 1983 ; Johnson et al., 1985 ; Johnson et al., 1987 )。而且 Pinkel et al., 1982 年亦曾发现 X 精子 DNA 含量多过 Y 精子 4%。

在早期使用 Flow Cytometric 仪分离 X 和 Y 精子前必须将精子的尾巴细胞质和细胞膜弃掉，所以分离出来的 X 和 Y 精子是死的，以致无法作为授精之用。但是近两年来美国农业部生理专家强生博士等研究人员已可将已经分离而且有活力的活精子使用输卵管授精法给予授精母兔和母猪，并成功生产活的仔畜 ( 表 1、2 )。

表 1 兔子预选 X 和 Y 精子以及经由输卵管授精仔兔之性比例*
精子处理别	头数		出生仔兔头数和百分率
	授精数	分娩数	预选		生产
			公 (%)	母 (%)	公 (%)	母 (%)
Y 精子 X 精子混合 X 和 Y 精子	16 14 17	5 3 5	81 14 50	19 86 50	17 (81) 1 (6) 6 (43)	4 (19) 15 (94) 8 (57)
合计	47	13	---	---	24 (47)	27 (53)
资料来源：Johnson et al., 1989. Biology of Reproduction 41：199-203 * ：每边输卵管注入 3×10⁵之精子

表 2 预选猪 X 和 Y 精子以及经由输卵管授精後仔猪之性比例 *
精子处理别	授精头数／分娩头数	仔猪生产头数	平均每窝产仔头数
				预选		生产
				公 (%)	母 (%)	公 (%)	母 (%)
Y 精子 X 精子不分离染色不分离不染色	8／4 10／5 11／5 7／5	37 34 40 46	9.3 6.8 8.0 9.2	77 20 50 50	23 80 50 50	68 26 43 52	32 74 57 48
资料来源：Johnson et al., 1989. Biology of Reproduction 41：199 - 203 *：每边输卵管注入 3×10⁵ 之精子

动物子代性别的控制，迄今仍为生殖生理学家和动物研究人员欲努力的目标。虽然有众多报告宣称已获得了某种程度的成功。甚至於申请过专利 ( 人 )。但据了解迄今在动物方面仍然没有一种可随心所欲或一致的方法先预知出生前的性别。

因出生前能预先知道动物性别有下列的好处：(1)可以加速遗传改进。(2)提高生产效益和增加经济效益。(3)畜群饲养管理简易。在前述的胚胎性别鉴定方法中，虽然有数种方法可预先测定胚胎之性别，而且其精确度也很高，但是，因其胚胎经抽取细胞或分切，使胚胎的存活率降低，经移置後也影响其受胎率，花费的成本极高。所以此技术也只限於非外科取胚选胚的单胎动物。

近几年来发展分离 X 和 Y 精子技术已近成熟阶段尤其利用 Flow Cytometric 仪分离经去尾和细胞膜的 X 和 Y 精子成功以後。迄 1989；1991 年美国农业部动物生理学家强生博士更利用 Flow Cytometric 仪分离仍有活力的精子，而且将分离仍有活力的 X 和 Y 精子经由母体输卵管授精成功地产下 94% 母仔兔和 81% 公仔兔以及 74% 母仔猪和 68% 公仔猪。

虽然利用 Flow Cytometric 仪可分离 X 和 Y 精子，因在分离之过程中损伤精子程度极高，分离的速度也嫌太慢，尤其对多胎动物需众多数目的精子来授精仍嫌不足。所以如何能很迅速地一次分离足够正常人工授精的精子数目，而且不损及其精子活力和型态，更不影响其授精後的生育能力，此为往後分离精子必须改进努力的目标。