毒素性大肠杆菌与芽胞梭菌

熊谷清孝 *1　伊藤隆 *2　小沼　成尚 *1　八柳　润 *3　斋藤志保子 *3

　　1992 年 11 月至 12 月，某一饲养母猪 100 头的养猪场，发生瘀哺乳猪下痢为主要症状的多数病例。

　　疾病发生於生後 1 - 2 周龄之哺乳猪，出现乳白色粘稠性乃至激烈的水样性下痢。疾病发於 1个月期间分娩的 16 胎 227 头中，30 头经过数日即死亡。死亡小猪剖检 3 头，共同的特徵是小肠及肠间膜淋巴结充血或出血，脑软膜下血管血液滞留。组织学上呈现小肠粘膜上皮坏死，固有层出血或充血，脑髓膜下血管水肿及出血。

　　细菌检查结果，从小肠分别分离到β溶血性大肠杆菌及 A 型芽胞梭菌 Clostridium perfringens ( CI.p ) A 型菌各 10 的 4.4 - 8.7 次方及 10 的 6.0 - 7.7 次方个。

　　大肠杆菌属於血清型 O149，附着因子 K88，以 Polymerase Chain Reaction ( PCR ) 检查毒素原生结果，LT、ST 为阳性，VT 为阴性。

　　以抗大肠杆菌 O149 血清实施酵素免疫法，在小肠粘膜上皮表面检测到阳性物质。格兰氏阳性大肠杆菌则在粘膜固有层发现。

　　从死亡病猪的小肠中分离到毒素原性大肠杆菌 ( ETEC ) 及芽胞梭菌，剖检及组织所见呈现芽胞梭菌引起的坏死性肠炎病变，因而可认为大肠杆菌与芽胞梭菌之混合感染。

　　降低哺乳期事故之发生，乃是养猪经营降低生产成本的关键。细菌感染引起的哺乳猪之下痢，大部份是由大肠杆菌或芽胞梭菌单独感染引起。

　　在日本此两种细菌单独感染引起的病例，不胜枚举。虽然在美国常见此两种细菌的混合感染例，但是在日本则甚少混合感染之报告。

　　本病例是发生於某一养猪场的哺乳猪，以下痢为主要徵状的疾病，从细菌学及组织病例学检讨结果，认为是大肠杆菌与芽胞梭菌之混合感染。

　　发生本病的养猪场，其规模为繁殖母猪 100 头，肥育猪 900 头，使用市售的配合饲料。

　　本病发生於 1992 年 11 月上旬，生後 1 - 2 周龄之小猪出现乳白色粘稠性乃至水样性下痢，元气消失，被毛逆立等症状。通常同胎全部乳猪会发病，在一个月内 16 胎 227 头中共有 30 头经过数日即死亡。

　　就发病死亡的 3 头 1 周龄死亡猪，实施病理学及细菌学的检查，并对同养猪场的发病小猪及母猪粪便，实施细菌学的检查。

　　剖检後取各器官，以 10%中性缓冲福马林固定，石腊包埋後制作组织标本，HE 及格兰氏染色後镜检。并委托家畜卫生试验场东北支场，实施肠管之抗大肠杆菌 O149 家兔血清酵素，血清酵素抗体法检查。

　　死亡猪之实质器官，以 5%绵羊血液琼脂，GAM 琼脂及 DHL 琼脂，实施厌氧及嗜氧性培养。又从剖检猪之肠内容，发病猪及母猪之粪便，以平板稀释法测定菌数。

　　大肠杆菌以 Biotest 1 号 ( 荣研 )，芽胞梭菌以 RAID ANAEROBE PANEL ( Micro Scan )，检查生化学性状鉴定。

　　分离大肠杆菌之组织侵入性 ( InvE )，易热性肠毒素 ( LT )，耐热性肠毒素 ( ST )，VERO 细胞毒 ( VT1 及 VT2 ) 产生能等以混合 Primer 法实施 PCR。PCR 反应液之组成如下：KCL 50 mMOL，Tris - HCL 10mMOL ( pH 9.0 )，TritonX - 100 0.1%，DNTP'S 100mMOL，LT 之 PRIMER 为 0.5mMOL，ST 的为1.0uMOL，InvE 的为 0.2uMOL，VT 的则为 1.0uMOL，Mgc12 2mMOL；Tag DNA Polymerase 1.25U/25ul，template DNA SOLUTION 2.5ul，全量以 25ul 实施反应。反应後，反应液以 3% agavose 电泳，检测增幅断片。

　　以 1% fructose，3% peptone 加 cooked meat broth 制成毒素液，接种 A 型抗毒素血清 ( 千叶县血清研究所 ) 於小白鼠，以实施中和试验 ( 家畜卫生试验场东北支场 )。分离 Cl.P α毒素之定量，是以 Evans 之方法及小白鼠接种试验实施。

　　到现场检查时，剖检呈水样性下痢症状死亡的 1 周龄小猪 3 头。共同特徵为小肠之充血或出血，腹腔内有发散恶臭的暗赤色内容物。此外尚有肠间膜淋巴节之充血，脑软膜下血管之血液滞留等。

　　从实质器官分离细菌的结果，有个体差异。但从小肠内容物则均能分离到 β 溶血性的大肠杆菌及芽胞梭菌。分离菌数各为每 1 公克肠内容物 10 的 4.4 - 8.7 次方及 10 的 6.0 - 7.7 次方个。

　　分离大肠杆菌均显示定型的生化学性状。血清型均属 O149 型，并均具有附着因子。

　　PRC 检查结果确认具有 LT 及 ST 产生性遗传基因。毒素产生能检查结果，与 PCR 检查结果相同。

　　分离得的毒素原性大肠杆菌对於供试 11 种药物，仅对 Oxolinic acid，Phosphomycin 及 Gentamycin 具有感受性，对其他 8 种药物则具有抗药性 ( 表 2 )。

NO.1

NO.2

NO.3

空肠

回肠

结肠

肝脏

肾脏

脾脏

心脏

肺

脑

8.6

．

7.7

．

+++

．

8.7

．

6.0

．

+++

4.4

6.6

6.0

6.6

　　　　　　　　　 +++：菌落发现 31 - 100 个，数值为常用对数值

　Ampicillin　　　　Oxytetracycline　

　Amoxicilin　　　Doxycycline　　

　Streptomycin 　　Phosphomycin　　+++

　Kanamycin　　　Oxolinic acid　　 +++

　Genamycin　 ++　　Furazolidone　　

　Colistin　　　

　　　　　　　　　　：抗药性　　　　　　　　+：相对抗药性

　　　　　　　　　　++：相对感受性　　　　　+++：强感受性

溶血性大肠菌

母猪

发病猪 No.1

发病猪 No.2

发病猪 No.3

发病猪 No.4

4.7

4.5

7.6

4.6

7.8

　　3 病例共同的病变为脑髓膜下血管之水肿变性与轻度出血，实质部有神经胶质细胞的聚集与粗松化及出血。空肠及回肠粘膜上皮之坏死，脱落，固有层之充血及出血格栏氏染色切片，粘膜上皮有格兰氏阴性杆菌附着，固有层则有格兰氏阳性杆菌存在。以大肠杆菌 O149 家兔抗血清实施的酵素抗体法染色结果，粘膜上皮出现显示对 ELISA 呈现阳性反应的抗原物质。

　　现场检查时发生下痢的小猪 4 头及母猪之细菌培养检查结果，每公克粪便中分离到 β 溶血性大肠杆菌 10 的 4.5 - 7.8 次方个。但没有分离到芽胞梭菌。

　　细菌感染引起的哺乳猪之下痢，大部份是由大肠杆菌或芽胞梭菌引起。从发生下痢病猪分离的大肠杆菌，其血清型以 O149、O141、O8 为最多。其中血清型 O149 为具有 k88 附着因子，而一般认为是猪肠道的病原株。本报告中所分离到的 β 溶血性大肠杆菌，血清型属於 O149，并具有附着因子 K88。下痢原性大肠杆菌之病原因子，除了附着因子外，尚有肠毒素。本报告中所分离到的菌株，均能产生 LT 与 ST。

　　芽胞梭菌在哺乳猪的感染例，大部份是毒素型 C 引起。芽胞梭菌 C 型菌之感染，发病极早，生後不久即会发生。而且大都是 C 型菌单独发生，经过极为急性及死亡率有极高的倾向。反之，A 型菌感染之发病日龄较大，主要发生於肥育期至成猪期。A 型菌被认为是引起非传染性坏死性肠炎的细菌。鸡的坏死性肠炎大都由 A 型菌引起，其发病需要适於芽胞梭菌发育之环境，例如球之感染或饲料之变化等。Amtsberg 亦曾报告，芽胞梭菌 A 菌单独感染时不会引犊之肠毒素血症，但与大肠杆菌 O78 合并感染时，则可引起肠毒素血症。芽胞梭菌在猪之感染，C 型菌经口感染後，会附着小肠绒毛而侵入粘膜下层，引起坏死性肠炎。A 型菌则虽已明了 α 毒素在形成病变上占有非常重要的角色，但经口感染後并不附着於小肠绒毛，形成坏死性肠炎之病变过程，尚未明了，仍待将来进一步研究解明。

　　芽胞梭菌与毒素原性大肠杆菌感染之组织病理学变化之比较，前者之特徵为粘膜组织之坏死及出血，後者则不发生坏死而仅有粘膜固有层之水肿。本病例 (1) 在组织病理学上酷似芽胞梭菌引起的坏死性肠炎，(2)在粘膜上皮表面呈现 O149 之阳性抗原，(3)从发病养猪场的发病猪及母猪之粪便中分离到毒素原性大肠杆菌，(4)分离得的芽胞梭菌非属强毒株，故可能先由毒素原性大肠杆菌造成肠道的损伤，然後由芽胞梭菌增殖形成坏死性肠炎之形态。

　　本报告中对於所分离得之大肠杆菌之肠毒素产生能之检查除了传统的方法外，尚使用 PCR 法。PCR 法以 LT、ST、InvE、VT 等混合 Primer 法实施，故不仅可检测出毒素原性大肠杆菌，尚可检测组织侵入性，肠道出血性大肠杆菌。本报告所使用的 LT 之 Primer 可同步检测 LTh、LTp、ST 之 Primer 亦可同时检测 STm 及 STp。又本报告中所使用的 VT 之 Primer，经渡边与工藤等以培养细胞法与毒素检出比较结果，VT1、VT2、VT2ha、VT2hb、VT2vp 均与培养细胞之结果相同。PCR 法能够在比较短时间内实施，并可同步检测组织侵入性及其他复数毒素之产生性，故可认为是省时省力而有效的方法。

　　依据家畜卫生技术指导事业之报告，1992 年日本发生猪感染性下痢头数约 1,600 头，死废率约 45%。其中早发性大肠杆菌症达约 67%，坏死性肠炎约 10%。但在美国之报告，哺乳猪 247 头实施病原检查结果，单独感染大肠杆菌的占 15%，单独感染芽胞梭菌的占 7.3%，大肠杆菌与芽胞梭菌混合感染的占 8.9%，与 1988 年之报告比较，混合感染病例有增加的趋势。

　　本主报告中所报导的混合感染病例，希望能够引起大家的注意。

　　本报告之完成，获得农林水产省家畜卫生试验场九州支场中泽宗千生先生，同东北支场滨冈隆文先生及播谷亮先生等之指导及协助，谨申谢意。