免疫学在酶菌病症上的应用

梁仁忠

    免疫学在细菌性或病毒性疾病的应用已广为人知，譬如∶疫苗的接种、抗毒血清的使用或者单簇群抗体在疾病诊断上的应用┅┅等等，在在都和我们的生活息息相关。至於免疫学在酶菌病症上的应用则较少为人们提及，其原因不外乎酶菌引起的病症，一般来讲较个别化，所造成的损失也不像细菌性或病毒性疾病那麽的急剧猛烈，因此之故，免疫学在酶菌病症上的应用，不似在细菌性或病毒性疾病上的应用，那麽普遍及广泛。

一、前  言

    免疫学在酶菌病症上的应用一般来讲较具各别性，其发展大都是根据特殊目地而设计，兹例举三项应用项目，以说明其使用及制备方法，希望能够增进吾人对这些方法的了解，并从而应用之。

    (1)免疫治疗 ( immunotherapy )

    (2)免疫扩散试验 ( immunodiffusion  test )

    (3)免疫组织化学诊断法 ( immunohistocheimical  methods  for   diagnosis )

二、抗原的制备

    以上三种方法，不论是那一种方法，首先要做的就是抗原的制备。抗原的制备第一步，先要收集培养大量的菌原，各种不同的酶菌，其生长环境可能有不同的需求，无法在此一一例举，仅以丝酶菌 ( Pythium  spp. ) 为例加以说明∶

  丝酶菌是一种水生真菌，生长在高温多湿的热带或亚热带地区，丝酶菌症的发生一般都在夏天或晚秋，最常引起马或狗胸部、腹部及肢端的皮肤病变，偶尔也会在肠道引起慢性的嗜伊红球性肠炎。丝酶菌可在 Sabouraud's  dextrose  agar ( SDA ) 或 vegetable  extract  agar ( VEA ) 上生长，首先将一小块病材用蒸馏水反覆冲洗，直至冲洗液清澈为止，而後将病材浸泡在含有 250 mg  ampicillin 的 10　蒸馏水中 15 分钟，处理过的病材即可置入 ager 中在摄氏 37 度下好气培养。经由初代培养後，选取含有丝酶菌菌丝的 agar  1mm 见方，用乾净的外科手术切开取出并切碎，重植於 SDA 或 VEA 中培养最少三天。培养後的 agar 切出的 20 块 1mm 见方，置於 2 公升的烧杯中，并加入 400　经灭菌的营养液 ( nutrient  broth )，37 度下培养 10 ~ 20，直到菌丝在液面上结成片状为止，而後将培养液倒掉，用 100　的灭菌生理食盐水将菌丝块冲洗三次，移出菌块至另一个乾净的大小适中的烧杯中，每个菌块加入 15　 的生理食盐水，在无菌状态下用超音波粉碎机打成均质，每 1　 装入一个秤过重量的乾净瓶子中，置入摄氏 80 度的恒温箱中过夜乾燥，定用减法计算瓶中固形物的重量，加入生理食盐水，使其浓度成为 5 mg／ml 生理食盐水，并调整其盐度，使成为等张溶液 ( 0.9mg  NaCl／ml ) 抗原悬浮液制成後，再加入苯酚 ( phenol ) 使其最後浓度为 0.5%即大功告成。菌苗可储存在摄氏 4 度的泳箱中二个月，其纯度可借接种至 SDA 或 sheep  blood  agar ( SBA ) 中，摄氏 37 度培养 24 小时判定之。

三、免疫治疗 ( immunotherapy )

    在动物酶菌病症的治疗上，不论是皮肤或是全身性的感染，欧美等先进国家经常使用外科切除的方法，其次是外部患处抗酶菌药剂的涂抹或是全身性经口或注射的药物给与，外科切除手术是一种很有效又省时省工的方法，但对动物造成的紧迫较大；药物给与虽亦有效，但费时费工，有时药物毒性较大，一个不小心反而造成中毒，因此，一种既安全又方便有效的治疗方法就在专家学者的努力下诞生，此方法就是免疫治疗法。

    利用免疫治疗法治疗酶菌疾病，其菌原的使用有专一性，不同属的菌种不互相反应，因此，临床上必须先确定病原菌的种类，对症下　菌＂方才有效。实行的方法非常简单，只要将上述方法制备的菌苗 2　 每礼拜皮下注射一次，连续三次即有 80%的治疗效果，接种部位的皮肤会有中到强度的反应，皮肤会有红肿痛的现象，因此，不可在同一部位连续注射。目前这种方法的应用只在皮肤病上，全身感染的应用，笔者没有找到相关资料，但值得一试。

四、免疫组织化学诊断法 ( immunohistochemical  methods  for   diagnosis )

    酶菌病症的初步诊断，一般是借助於肉眼及组织病理切片的观察，但是由於不同菌种间的类似性，病因的确诊必须靠菌原的培养才能确定，菌原的培养与鉴别需要一定的技术，况且有些时候病材已被丢弃，病原的培养根本不可能，因此，免疫组织化学诊断法被发展出来。这种方法可应用在组织切片上，就如同特殊染色一般，而且其特异性高，不同的菌种间不互相反应，因此，是一种非常好的诊断方法。

    要做免疫组织化学诊断法，首先要准备抗体，2　 的菌苗每周一次连续三次，打入成熟纽西兰白兔的血管中，在第三次接种的二天後即可从耳部血管采血，静置凝固後分离出血清，血清可冷冻保存。

    病理组织切片的制作遵循一般原则，用 10% 的福马林液固定，石蜡包埋，病材切成 4 um 的薄片，以二甲苯去石蜡後，覆以稀释 10 倍的正常马血清 20 分钟，以阻断非常特异的抗体结合反应，马血清的稀释以 0.05 M 的 PBS 行之，pH 值调至 7.2 到 7.4 之间。兔血清一样用 PBS 稀释十倍，和组织作用一小时後以 PBS 润洗，而後和稀释十倍的牛抗兔 IgG 过氧化　作用 20 分钟，再以 pH 5.2 的醋酸纳缓冲液润洗，其後覆以色原质溶液 ( 3ˉAminoˉ9ˉethylcarbazol ) 40 分钟，水洗後以 Mayer's  hematoxylin 复染即成。染成的组织可清楚的显现出菌丝。

五、免疫扩散试验 ( immunodiffusion  test )

    活体的诊断也可藉血清学的方法做免疫扩散试验确诊，Mendoza 等在 1986 年比较三种丝酶菌抗原在双向免疫扩散试验的效果，结果发现以培养液过泸後所得的抗原 ( culture  filtrate  antigen ) 其效果最佳，保存期限最长最稳定，在双向免疫扩散试验中可得到 4 ~ 6 条的沉淀线。抗原制备的方法是将培养丝酶菌二星期左右的培养液，经过 0.002% 的 merthiolate 灭菌，过泸浓缩 20 倍後使用，培养皿 Agar 的洞直径 4 mm 间隔 4 mm，分别加入抗原和血清後，高湿度室温下反应 24 小时即可判读。

六、参考文献 ( 略 )

中国畜牧杂第五十三册合订本

1995年一月号至1995年六月号

第 27 卷 (95) 第 6 期 ( 29 ~ 32 )