世界對家畜繁殖的研究動向

１.緒言

      1991年1月13日至15日為止，在美國的Bonmass名開國際胚移植學會，出席者超過300人。

        日本山口大學農學部鈴木達行在1月14日下午3點半發表「有關牛的體外受精胚的冷凍保存上須強調的條件」。此有關牛的體外受精的公開討論(Panel discussion)之討論小組(Paneler)係由丹麥王立獸醫大學的Greve博士主持，其他的討論小組(paneler) 成員有劍橋大學的Lancaster博士，美國康耐爾大學的Young博士，加拿大Ontario獸醫科大學的Xu博士，法國INRA的Marquant-Le Guienne博士，在最後英國劍橋大學遺傳生理學研究所的Moor博士也來參加。

        此次學會的發表文章有137題，其中美國、加拿大分別發表42篇及16篇，其次日本、愛爾蘭各10篇，而日本及中國的發表更引人注意(如表1)。出題研究發表係由2人主審。由研究項目看以體外受精最多、其次為遏制排卵處理、胚冷凍、核移植的順序，有46，22，11，10題。依動物別看年係壓倒性的多，豬、綿羊、鼠的順序為71、10、7、7題(表2)。以下係發表的主要課題。

表1.  1991年度國際胚移植學會的研究發表數

表2.   研究發表的項目與動物別

其他在本項目沒有包含在內之先端研究，將來展望等有22個報告，動物別   雞及魚也包含在內。

２.過剩排卵處理

        1月13日上午Mc Gurk博士、Christie博士介紹乳用牛的胚移植之實際，Boland博士報告牛的過剩排卵處理，Pieterse博士報告超音波診斷對牛卵胞卵子的吸引採取法，此等概要介紹如下：

        一般PMSG投與因面中的半減期延長，故在黃體期大型卵胞容易殘留。抗PMSG投與時，大型卵胞減少，PMSG投與時看不到正常胚有增加的傾向(Boland et al, 1991)，FSH因在血中的半減期短，故賀爾蒙投與次數必須增加才可，但能增加可以移植的胚。

        Goulding博士(1990)的試驗，係性週期的第2日與第10日以4日間早晚投與FSH(Folltropin)之過剩排解處理，其可移植的胚分別為0.7±0.2與2.1±0.4個，後者有顯著的提高。

        Humphrey博士等(1979)的報告，PMSG中的FSH之比例比LH高時過剩排卵處理效果高。FSH與LH之中，LH內的sial酸濃度低時，在FSH內則含有高濃度，而半減期係受此濃度左右，LH與FSH係有此等的30分與110分之比例。

        Murphy博士等的研究，LH/FSH高時過剩排卵處理效果降低。理想的比例係FSH:LH=5:1能控制良好的排卵數。在FSH係加LH排卵數有減少的現象，判斷LH活性有阻止排卵的作用。在此情形LH的卵胞膜細胞與顆粒膜細胞上的接受器(receptor)機能有減少的傾向。在PFSH45μg添加Pure LH的4,500，900，450，150，75，45μg之過剩排卵試驗，4,500μg與900μg之高的添加例及75μg與45μg的低添加例，兩者的成績不良。

        Donaldson博士與Ward博士(1985)以PFSH(Superov)投與得到良好的過剩排卵成績。

        Folltropin的10~30mg投與比PMSG有效。PMSG投與比FSH及hMG投與比較容易有大型的卵胞殘留。抗PMSG投與後1小時PMSG約減少85％。其報告係PMSG投與之過排卵處理後並在PG投與後第60小時投與抗PMSG可提高受精率。Dieleman等(1987)報告抗PMSG投與後血中PMSG濃度急激的下降在2小時以內消失。但鈴木達行的資料沒有得到上述的試驗成績。

        Roche博士及Boland博士等的研究，FSH在性週期的第1、2、3、4及6日投與，在其第5日調查Scanning卵胞，僅性週期的第1及2日處理後的例子，卵胞持有的卵胞水顯著的增加。但此等形成的卵胞，沒有看到動情素(Esterogen)的活性。其後的Hormone處理是否能提高過剩排卵之處理其效果成為關鍵。

        Gray博士等的報告，在性週期的第2與第3日投與FSH-P   5mg之前處理，並在同性週期的第10日以FSH-P，36mg的減量投與之過剩排卵處理，試驗與沒有前處理的過剩排卵處理(Control)牛群比較，可能移植的胚分別為4.67個與4.5個，兩者差異不顯著。

        又在黃體期有大型卵胞殘留者，於行2次的檢查時，卵胞的直徑有減少的牛群對過剩排卵處理成績，其可能移植胚得到7.25個的良好結果。此大型卵胞在卵巢上存在，其大的卵胞有減少的傾向，卵胞液中的Esterogen活性沒有時，testesterone及progesterone活性加強，表示對過剩排卵處理效果沒有不良影響。

        Donaldson的FSH投與之牛隻過剩排卵處理法係以Super ov^(R)75IU分3日間3次及6次與8次投與區，其可供移植的胚分別為6.1±6.6，5.4±6.0，6.2±5.7個。各試驗區的差異不顯著。此等試驗結果係為看減少FSH投與次數之過剩排卵處理的簡易化，認為係其優點所在。

        供胚牛對過剩排卵處理之連續供用，一般可看到可供移植的胚減少，但Hasler博士等(1983)以1000頭牛連續供用，過剩排卵處理後之成績差異不顯著。

表3.  FSH中添加 LH 450μg過剩排卵後荷蘭牛及夏拉萊(Charolais)的成績

                                                                                                                                    (Chupin等1987)

表4.FSH投與對牛的過剩排卵處理成績

(Donaldson, 1991)

３.分離胚的移植

        1月13日下午Bondioli博士，Kippax博士，Gray博士，Herr博士以商業基本上的胚之marcomanipulation的利用法而報告。

        Kippax博士等以210個的牛新鮮胚於第6.5~7.5日回收分離後分手術及非手術的移植。胚用玻璃針或金屬刃分離。試驗1的分離胚納入透明帶內，試驗2 一部份而在透明帶內，其他部份由透明帶提出，試驗3不納入透明帶內而移植，其受胎率分別為60、57及57％。分離胚僅1個手術的或非手術的移植，仔牛的生產率分別為121個113%。分離胚僅2個移植之例，試驗1、2、3其分別為63、35、43%，試驗1有顯著的提高(P<0.05)。

        Gray博士的報告，1988年牛的分離胚之移植997頭得到(50.2%)的受胎例。以分離目的所使用的桑實胚，初期胚盤胞，胚盤胞胚其受胎率分別為51.6，47.3，44.4%，又1卵性得雙子的有27.7%，僅得1子的有44.8%，沒有得到仔牛的有27.5%。由此成績看牛胚分離技術係增加仔牛的有效方法。

        澳洲的Herr及Reed博士以4~10個的細胞由桑實胚及胚盤胞取出，探出Y染色體以YCD assey作性判別。30個中的16個牛胚行生體檢查，性別判定後的移植試驗，30頭之中有16頭(53.3%)受胎。又生體檢查性判別後冷凍保存，27個中有17個(63%)受胎。field的性判別技術的導入係assey的結果，但在1~2日以上尚存在問題。由人胚的生體檢查之性判別，據報告在性的結合能防止缺欠連絡部分的傳播。家畜胚對生檢(Biopsy)的性判別生存的雌雄之性缺陷也有可能發現。又生檢(Biopsy)之性判別的技術係以DNA為基準(Base)之標示(maker)有必須加以敘述之。

４.牛卵胞的內分泌機構

        Driancount博士對綿羊及牛的卵胞機能報告，對所知的新的內分泌機構有詳細敘述。綿羊及牛在卵胞的階段(stage)急速的補充性刺激賀爾蒙及動員為著排卵卵胞數的調整，使引起規則的間隔(interval)。因此有內分泌，組織間分泌(卵胞間)，外分泌(卵胞內)的信號(signal)組成。此信號係發育因子，主要者為表皮細胞發育因子的外分泌活性末端的調整。在綿羊動員的卵胞群之中，大型卵胞係雌=醇(estradiol)及inhitibin的負的回饋(feed back)，其他卵胞的FSH活性係被動的。此對牛係成熟卵胞而來的未確認之組織間分泌，其他的卵胞發育以能動的抑制之。綿羊及牛係在其他卵胞的退行之間，排卵卵胞的維持係LH受容體的分化，胰島素(insulin)類的生長因子係在外分泌刺激下而進行。

        緊張性卵胞的發生係受卵胞刺激賀爾蒙的要求。緊張性卵胞的發生，係在綿羊的卵胞達2mm，牛4mm時開始。巨大卵胞的形態(數量、大小、閉鎖)在牛及綿羊發育開始的時期出現為特徵。排卵前的卵胞大小，綿羊與牛分別為6~8m，13~18mm，顆粒膜細胞係3×10⁶個，15×10⁶個進入閉鎖，看到2~4mm大的卵胞群(group)。

        何時能確認排卵卵胞？排卵卵胞由何處來？為著確認排卵卵胞用超音波診斷可得到很正確的推測，在燒灼法的墨水印，卵胞膜細胞與顆粒膜細胞兩者結合，可由LH活性推測之。卵胞靜脈面中的類固醇(steroid)濃度的不同，為著雌二醇(estradiol)卵胞的發生而供給，並伴隨小型卵胞的變化。為著高的排卵率，投與外因性的性刺激賀爾蒙，並裝置超音波診斷裝置而鑑察之，判斷卵巢由大而縮小。

        但是牛及羊在發情前確認排卵卵胞是困難的。綿羊PGF₂α投與後0、4、8、12、24與48小時，隨發情確認排卵卵胞分別有0／7、1／7、1／7、4／7、5／7與5／7頭。此與牛相同。在黃體期究係那個細胞排卵？其大小為著能確認，須用燒灼法判斷才可。在綿羊的卵巢，對黃體的退行，有排卵的機會(Chance)，卵胞的大小判斷有2mm以上。在牛黃體退行時的卵胞大小有不少係3~4mm大。牛及綿羊通常2~5個的卵胞被選擇，係急激的激性腺素分泌細胞(gonadotrophin)浸潤而引起的。卵胞數在程別的特徵的數值達到時，表皮細胞較為減少。被選擇卵胞的活性成為優勢，相反的減少過多的卵胞。卵胞的大小增加而顆粒膜細胞與卵胞膜細胞的有系分裂活性減少。一些調節機構如胰島素(insulin)之類的發育因子及線維芽細胞發育因子與2種重要的蛋白，inhitibin及actibin係顆粒膜細胞生產的，表皮發育因子係由卵胞膜細胞生產。綿羊的卵胞以短時間顆粒膜細胞共同培養與顆粒膜細胞的DNA內有3H timegin組成係insulin發育因子及表皮發育因子。

FSH係體內或培養後在卵胞內生產芳香性，而活性化。顆粒性細胞的平板(plate)上係柔和的芳香性分離發育因子及蛋白。胰島素發育因子，表皮發育因子與actibin係生產芳香性使FSH活性化。inhitibin與holistatine效果發揮或胰島素發育因子與表皮發育因子係與蛋白結合，抑制FSH的芳香性。

        牛的卵胞膜係在體外對雄性素(androgen)的分泌。雄性素與其生成物刺激LH而生成，沒有FSH。卵胞膜細胞上的LH活性係發育因子及蛋白，而柔和顆粒膜上的胰島素發育因子增加時，卵胞膜細胞所生產的表皮發育因子刺激LH而抑制雄性素的活性。inhitibin及actibin係行相反的動作。inhitibin刺激LH而增進雄性素的活性。actibin抑制LH的活性。FSH的補充對卵胞的大小不同，小型的卵胞群富有表皮發育因子，每個細胞上的發育抑制是敏感的。

        由卵胞的大小看FSH的刺激效果對大型卵胞是顯著的，對小卵胞群是弱的。大型卵胞在關節上係控制其他卵胞的發育。在FSH濃度減少時，抑制其他卵胞的發育，並在面中抑制FSH活性。綿羊係卵胞內的雌二醇與inhitbin控制FSH的分泌。大型卵胞的發育，雌二醇及inhitibin增加。其負回饋能抑制其他卵胞中的FSH濃度。在黃體期對大型卵胞的存在係不引起過剩排卵。牛大型卵胞的存在對PMSG及PFSH的過剩排卵效果減少。inhitibin對免疫處理也不能變更FSH的排卵數。在牛的卵胞液含有inhitibin的種種合成物質以抑制卵胞發育。大型卵胞係比小型卵胞對FSH有明顯的敏感。此情形在陽性的內分泌活性下，引起FSH活性的大增，使在卵胞內的胰島素發育因子提高濃度。

        因此被FSH刺激後胰島素發育因子的成長，係促進雌二醇的生成。此係FSH刺激顆粒膜細胞的胰島素發育因子的結果。胰島素發育因子的增加。顆粒膜細胞的芳香性也增加，致雌二醇的量上昇。所以胰島素發育因子能增加芳香性的FSH活性，LH接受器(Receptor)的數量也增加。LH的分泌係維持高的卵胞內CAMP的細胞內水準。其次FSH濃度的減少CAMP的刺激也減少。

５.牛的育種改良應用受精卵移植技術 　

        丹麥的Christensen博士介紹牛的育種改良應用胚移植法如下述。到目前為止的方法係被選拔後雄仔牛的分娩母牛用作供胚牛行胚移植的方法，其遺傳改良率低。此選拔後分娩公的母牛對年齡能預測，並偏向改良量。此對選拔用於仔牛生產，以年青母牛作供胚牛方式，可得30~50％的遺傳改良量。

        此情形使用年青母牛作胚移植及其他的尖端技術(體外受精、核移植等)之驅使，使遺傳的改良率提高，得到雜種強勢(heterosis)的機會(chance)。

        (1)選拔優良母牛。

        (2)由優良母牛回收的胚移植在普通的母牛。

        (3)公仔牛係調查發育性、強健性、飼養性、機能適正等，在生後10~12個月後正年青時被選拔，由其成績結果選拔供人工授精。

        (4)母仔牛在初回泌乳記錄，係供將來的供胚牛而進入核心牛群。

        (5)由3個群構成

        A、胚移植與其他新的技術產生遺傳的改良面而生產仔牛。此情形的仔牛，也能夠由外部導入。

        B、泌乳記錄與公牛的檢定作基礎群。

        C、未記錄牛群

        (6)遺傳的選拔公牛的精液使用於A及B的母牛。

        (7)A與B的核心牛群係以人工授精及由外部導入係供胚移植用。

６.牛的核移植

        1月15日Willadsen博士演講有關牛的核移植。8~64細胞期的牛胚回收後，此等的分割球經與分散，除去核後成熟卵子的細胞與電氣的融合作出核移植胚移植於320頭後其結果，128頭(42.4%)受胎。懷孕牛之中14頭(4.6%)第90日流產，另有4頭(1.3%)在第6~8個月流產。110頭繼續懷孕，在分娩時10頭死亡，得到100頭(33.1%)的產仔數。核移植胚之中優良胚得到50~60%的受胎率，不良胚僅20%的低受胎率。此試驗結果1卵性4仔5組，1卵性3仔10組，1卵性雙仔13組，1卵性1仔24例，1卵性5仔以上的Croning沒有得到。核移植能為今後商業採用(Comamercial base)為技術的進展。1世代，2世代的試管(invitro)繼代進行的試驗成績也有發表，茲介紹有關核移植的2、3個報告。

        Stice博士等(1991)以過剩排卵處理後母牛的高溫停止狀態(standing heat)後第24~48小時回收未受精卵子。核的除去係進行除去第1極體週邊的細胞質(Karyo plast)係由供胚牛而來的，又在核移植係使用所作出的10~50細胞期胚。電氣融合係在2.3KV／cm：15μsec的條件下，Karyo plast在除核細胞(cyto plast)間進行。核融合細胞係用寒天包埋綿羊的輸卵管之假移植4~5日間。在此情形的核移植胚較能得到胚的karyo plast，係用在其次的世代的核移植使用。綿羊的輸卵管培養期間(4或5日)，核移植胚的發育不受影響(20%VS16%：P<0.1)。胚葉細胞(Blastomere)的數量4日(17.8)比5日(28.1)少差異顯著(P<0.001)。此等的核移植胚的核融合用胚除核後，細胞質(cyto plast)融合後的例係第4日胚，與其他階段(stage)的胚比較表示有高的融合率(68%VS57%；P<0.001)。

        中國的Yong博士等(1991)由山羊的細胞質(cyto plast)的1/2切斷除核，與4~32細胞期胚的胚葉細胞(Blastomere)組合，置在含有5μ／ml的cytochalasin B(細胞骨骼抑制劑的一種)的PBS內，以45VDC pulse 40μsec通電融合，以15%FCS加在PBS內培養1~3小時。融合30個，能夠融合的移植，24個得到5組的產仔。日本的牛島氏等(1991)有對牛核移植成功例的報告，茲評述本例ET新資如下。

        Loskutoff博士等(1991)以含有20%發情時血清之TCM─ 199液26小時的培養牛卵子。1×10⁶個精子培養18小時後在第42小時將胚葉細胞(Blastomere)採出，移入4個透明帶內培養。在授精的第192小時，以排卵卵胞控制胚盤胞胚的比率與體外受精胚其分別為57.9%(11/19)與43.4%(33/76)，在兩者有看到顯著差異性。19個操作胚之中胚盤胞的發生比率以0、1、2、3與4組，其分別為3(15.8%)，5(26.3%)，6(31.6%)，4(21.1%)與1(5.3%)。表示有可能作出特有同一遺傳子Croning。

表5.牛的核移植之繼代  (Stice等1991)

７.結論

      在最後的一日Calorado州立大學的Seidel博士演講胚移植過去20年的成果，其次講述在100年間對技術的進展。胚移植的進展到此的判斷為一階段的科學究明，仍為尚未知的成果。由此之後50年胚的移植技術將更進展，並進入安定期。到此時期能夠急速的延伸行對醫學方面的貢獻。

        胚移植的進展伴隨體外培養，體外受精，核移植技術的展開，並產生新的技術。Seidel博士的預想，由體細胞的移植，體外配偶子的形成，胚幹細胞，胚芽細胞或非胚芽細胞的移植，雌性前核或雄性前核在單為生殖，一定期間的體外之懷孕，人工的染色體之形成，染色體的移植等之分階段的敘述，在此情形科學的進步是日新月異的。由此首先有獨創性與開拓性之驅使，希望能指揮世界研究及技術的開發。

                                                                                             飼料營養雜誌(p.59~69)－康天旗．九二年第七期

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