動物胚和精子之性別鑑定技術

如何能很迅速地一次分離足夠正常人工授精的精子數目，而且不損及其精子活力和型態，更不影響其授精後的生育能力，此為往後分離精子必須改進努力的目標。

各種動物因性別之不同而其生理解剖上亦有所差異，因此在飼養上和市場的價格上的經濟收益差異也很大。在理論上動物公母之性比例約在 1：1，所以在自然狀況下之性比例也只有公母各半的機率。

近二十年來有關動物性別的控制技術已有相當程度的進展，其中如利用體外授精，核移置和細胞融合技術之發展已可獲得正常懷孕和分娩仔豬的報告，因體外授精、核移置和細胞融合技術之發展則大量增加了胚胎的來源，則胚胎之性別控制上可應用細胞學的方法或胚胎顯微分切來檢定性染色體，在胚胎分裂發育至適合於移置時給予性別鑑定始再行移置，但是，因使用染色體以檢定性別的檢出率低，檢定的時間長，往往也因胚胎難免受損而使移置後其受胎率降低。

其他性別鑑定的方法如 H–Y 抗原已證實可應用在牛、綿羊和豬等家畜，使用此項技術在胚胎性別鑑定的準確率分別為 77–88% 和 82–89%，正確性相當高。此項技術應用在牛胚胎或單胎動物胚胎上有其實質上的經濟效果，但如應用在豬胚胎，因其性別準確率不如單胎動物，所以其經濟效益上無法與單胎動物相抗衡。

在性別控制技術上另一種方法是精子中具有 X 和 Y 染色體的分離。在人類和實驗動物方面已有相當程度的成功率，但是利用這些技術應用在家畜的精子分離，則因參與的動物頭數不多或未能重複試驗致使缺乏說服力。近幾年來使用精子來控制性別比較有理論根據的學者有美國農業部的 Dr. Johnson 等人，( 1989；1991 )。他們以測定脫氧核甘酸 ( DNA ) 含量多寡的方法來判定其性別。其過程為將精子置入流動測定儀 ( Folw Cytometer ) 分離含有 X–染色體和 Y–染色體的精子。並已將分離的兔和豬精子經由輸卵管授精法獲得生產特定性別之動物，此方法也是迄今為止分離精子性別比較精準的方法。

此方法為抽取胚胎內的細胞經過適當的培養後在辨別 X 或 Y 染色體。因此方法抽取胚胎內的細胞時有損及胚胎之存活，致使經移置後其成功率很低。

從 5.75 天囊胚期胚胎抽取 200 ~ 300 個滋養外胚層細胞 ( Strophectodermal cells )，將細胞固定和染色後鑑定 Barr body 的存在與否來判定其性別。用此方法鑑定性別有很高的精準率，但是胚胎的存活率卻很低 ( 16.5% )。

將 12 ~ 14 天之孵化囊胚期胚胎抽取 0.5 mm^² 之滋養外胚層細胞，組織切片細胞給予適當培養後，使用核型鑑定方法來判定其性別，經移置其受胎率很低 ( 38% )。

將 6 ~ 8 天孵化前之胚胎抽取少許滋養外胚層細胞組織切片，經適當培養後，再用核型鑑定方法來判定其性染色體。因此方法鑑定性別有 59% 的胚可以判定性別，但其分娩後仔畜性別之正確率僅 33%。

將 6 ~ 7 天的胚胎分切成兩半，經體外適當的培養後，使用核型鑑定方法來判定性染色體。以此方法鑑定性別有 60% 之半切胚可被鑑定性別。

以雌胚比雄胚生產較多之 X–Linked 酵素的特性來判別 X 或 Y 胚之方法。用此方法有 64% 之準確率。

H–Y 抗原為雄胚特有之蛋白質，經螢光染色後可以進行性別鑑定。由於方法不需要抽離細胞，而且在螢光照射下的時間也很短 ( 無傷害 )，經移置後其受胎率不受影響。此方法鑑定性別可達 80% 的準確率。

利用雄性特有之 Y–染色體基因探針可檢測出 57% 之細胞組織，其性別檢測的準確率可高達 95%。因此方法必須抽取細胞檢測，胚受損率高，致使影響移置後的受胎率很大。近年來國外正嘗試利用 Polymeric Chain Reaction ( PRC ) 技術企圖儘量減低對胚胎的傷害程度以便提高移置的受胎率。但此方法必須與儀器配合，故想見其花費的費用極為昂貴。

因人類 X 和 Y 精子的大小和比重上有差異，所以經此方法可以分離試驗動物和人類 X 和 Y 精子。1982 年 Beernnink and Ericsson 曾經使用此技術成功地分離人 X 和 Y 精子。但是利用此技術分離牛的 X 和 Y 精子，並將分離之精子給予授精、分娩，出生之仔畜性別則無明顯的差異。

利用雄性動物細胞表面持有特別之蛋白質 ( H–Y 抗原 )。並以免疫之方法生產 H–Y 抗體血清，在配合螢光染色技術可以辨別 X 和 Y 精子。利用此技術分離鼠和兔子 X 和 Y 精子則可獲得相當程度的性別改變 ( 母鼠 54.6%；母兔 63% )。

利用 Flow Cytometric 儀測定哺乳動物精子 DNA 含量已有報告 ( Garner et al., 1983 ; Johnson et al., 1985 ; Johnson et al., 1987 )。而且 Pinkel et al., 1982 年亦曾發現 X 精子 DNA 含量多過 Y 精子 4%。

在早期使用 Flow Cytometric 儀分離 X 和 Y 精子前必須將精子的尾巴細胞質和細胞膜棄掉，所以分離出來的 X 和 Y 精子是死的，以致無法作為授精之用。但是近兩年來美國農業部生理專家強生博士等研究人員已可將已經分離而且有活力的活精子使用輸卵管授精法給予授精母兔和母豬，並成功生產活的仔畜 ( 表 1、2 )。

表 1 兔子預選 X 和 Y 精子以及經由輸卵管授精仔兔之性比例*
精子處理別	頭數		出生仔兔頭數和百分率
	授精數	分娩數	預選		生產
			公 (%)	母 (%)	公 (%)	母 (%)
Y 精子 X 精子混合 X 和 Y 精子	16 14 17	5 3 5	81 14 50	19 86 50	17 (81) 1 (6) 6 (43)	4 (19) 15 (94) 8 (57)
合計	47	13	---	---	24 (47)	27 (53)
資料來源：Johnson et al., 1989. Biology of Reproduction 41：199-203 * ：每邊輸卵管注入 3×10⁵之精子

表 2 預選豬 X 和 Y 精子以及經由輸卵管授精後仔豬之性比例 *
精子處理別	授精頭數／分娩頭數	仔豬生產頭數	平均每窩產仔頭數
				預選		生產
				公 (%)	母 (%)	公 (%)	母 (%)
Y 精子 X 精子不分離 — 染色不分離 — 不染色	8／4 10／5 11／5 7／5	37 34 40 46	9.3 6.8 8.0 9.2	77 20 50 50	23 80 50 50	68 26 43 52	32 74 57 48
資料來源：Johnson et al., 1989. Biology of Reproduction 41：199 - 203 *：每邊輸卵管注入 3×10⁵ 之精子

動物子代性別的控制，迄今仍為生殖生理學家和動物研究人員欲努力的目標。雖然有眾多報告宣稱已獲得了某種程度的成功。甚至於申請過專利 ( 人 )。但據瞭解迄今在動物方面仍然沒有一種可隨心所欲或一致的方法先預知出生前的性別。

因出生前能預先知道動物性別有下列的好處：(1)可以加速遺傳改進。(2)提高生產效益和增加經濟效益。(3)畜群飼養管理簡易。在前述的胚胎性別鑑定方法中，雖然有數種方法可預先測定胚胎之性別，而且其精確度也很高，但是，因其胚胎經抽取細胞或分切，使胚胎的存活率降低，經移置後也影響其受胎率，花費的成本極高。所以此技術也只限於非外科取胚選胚的單胎動物。

近幾年來發展分離 X 和 Y 精子技術已近成熟階段尤其利用 Flow Cytometric 儀分離經去尾和細胞膜的 X 和 Y 精子成功以後。迄 1989；1991 年美國農業部動物生理學家強生博士更利用 Flow Cytometric 儀分離仍有活力的精子，而且將分離仍有活力的 X 和 Y 精子經由母體輸卵管授精成功地產下 94% 母仔兔和 81% 公仔兔以及 74% 母仔豬和 68% 公仔豬。

雖然利用 Flow Cytometric 儀可分離 X 和 Y 精子，因在分離之過程中損傷精子程度極高，分離的速度也嫌太慢，尤其對多胎動物需眾多數目的精子來授精仍嫌不足。所以如何能很迅速地一次分離足夠正常人工授精的精子數目，而且不損及其精子活力和型態，更不影響其授精後的生育能力，此為往後分離精子必須改進努力的目標。