毒素性大腸桿菌與芽胞梭菌

熊谷清孝 *1　伊藤隆 *2　小沼　成尚 *1　八柳　潤 *3　齋藤志保子 *3

　　1992 年 11 月至 12 月，某一飼養母豬 100 頭的養豬場，發生瘀哺乳豬下痢為主要症狀的多數病例。

　　疾病發生於生後 1 - 2 週齡之哺乳豬，出現乳白色粘稠性乃至激烈的水樣性下痢。疾病發於 1個月期間分娩的 16 胎 227 頭中，30 頭經過數日即死亡。死亡小豬剖檢 3 頭，共同的特徵是小腸及腸間膜淋巴結充血或出血，腦軟膜下血管血液滯留。組織學上呈現小腸粘膜上皮壞死，固有層出血或充血，腦髓膜下血管水腫及出血。

　　細菌檢查結果，從小腸分別分離到β溶血性大腸桿菌及 A 型芽胞梭菌 Clostridium perfringens ( CI.p ) A 型菌各 10 的 4.4 - 8.7 次方及 10 的 6.0 - 7.7 次方個。

　　大腸桿菌屬於血清型 O149，附著因子 K88，以 Polymerase Chain Reaction ( PCR ) 檢查毒素原生結果，LT、ST 為陽性，VT 為陰性。

　　以抗大腸桿菌 O149 血清實施酵素免疫法，在小腸粘膜上皮表面檢測到陽性物質。格蘭氏陽性大腸桿菌則在粘膜固有層發現。

　　從死亡病豬的小腸中分離到毒素原性大腸桿菌 ( ETEC ) 及芽胞梭菌，剖檢及組織所見呈現芽胞梭菌引起的壞死性腸炎病變，因而可認為大腸桿菌與芽胞梭菌之混合感染。

　　降低哺乳期事故之發生，乃是養豬經營降低生產成本的關鍵。細菌感染引起的哺乳豬之下痢，大部份是由大腸桿菌或芽胞梭菌單獨感染引起。

　　在日本此兩種細菌單獨感染引起的病例，不勝枚舉。雖然在美國常見此兩種細菌的混合感染例，但是在日本則甚少混合感染之報告。

　　本病例是發生於某一養豬場的哺乳豬，以下痢為主要徵狀的疾病，從細菌學及組織病例學檢討結果，認為是大腸桿菌與芽胞梭菌之混合感染。

　　發生本病的養豬場，其規模為繁殖母豬 100 頭，肥育豬 900 頭，使用市售的配合飼料。

　　本病發生於 1992 年 11 月上旬，生後 1 - 2 週齡之小豬出現乳白色粘稠性乃至水樣性下痢，元氣消失，被毛逆立等症狀。通常同胎全部乳豬會發病，在一個月內 16 胎 227 頭中共有 30 頭經過數日即死亡。

　　就發病死亡的 3 頭 1 週齡死亡豬，實施病理學及細菌學的檢查，並對同養豬場的發病小豬及母豬糞便，實施細菌學的檢查。

　　剖檢後取各器官，以 10%中性緩衝福馬林固定，石臘包埋後製作組織標本，HE 及格蘭氏染色後鏡檢。並委託家畜衛生試驗場東北支場，實施腸管之抗大腸桿菌 O149 家兔血清酵素，血清酵素抗體法檢查。

　　死亡豬之實質器官，以 5%綿羊血液瓊脂，GAM 瓊脂及 DHL 瓊脂，實施厭氧及嗜氧性培養。又從剖檢豬之腸內容，發病豬及母豬之糞便，以平板稀釋法測定菌數。

　　大腸桿菌以 Biotest 1 號 ( 榮研 )，芽胞梭菌以 RAID ANAEROBE PANEL ( Micro Scan )，檢查生化學性狀鑑定。

　　分離大腸桿菌之組織侵入性 ( InvE )，易熱性腸毒素 ( LT )，耐熱性腸毒素 ( ST )，VERO 細胞毒 ( VT1 及 VT2 ) 產生能等以混合 Primer 法實施 PCR。PCR 反應液之組成如下：KCL 50 mMOL，Tris - HCL 10mMOL ( pH 9.0 )，TritonX - 100 0.1%，DNTP'S 100mMOL，LT 之 PRIMER 為 0.5mMOL，ST 的為1.0uMOL，InvE 的為 0.2uMOL，VT 的則為 1.0uMOL，Mgc12 2mMOL；Tag DNA Polymerase 1.25U/25ul，template DNA SOLUTION 2.5ul，全量以 25ul 實施反應。反應後，反應液以 3% agavose 電泳，檢測增幅斷片。

　　以 1% fructose，3% peptone 加 cooked meat broth 製成毒素液，接種 A 型抗毒素血清 ( 千葉縣血清研究所 ) 於小白鼠，以實施中和試驗 ( 家畜衛生試驗場東北支場 )。分離 Cl.P α毒素之定量，是以 Evans 之方法及小白鼠接種試驗實施。

　　到現場檢查時，剖檢呈水樣性下痢症狀死亡的 1 週齡小豬 3 頭。共同特徵為小腸之充血或出血，腹腔內有發散惡臭的暗赤色內容物。此外尚有腸間膜淋巴節之充血，腦軟膜下血管之血液滯留等。

　　從實質器官分離細菌的結果，有個體差異。但從小腸內容物則均能分離到 β 溶血性的大腸桿菌及芽胞梭菌。分離菌數各為每 1 公克腸內容物 10 的 4.4 - 8.7 次方及 10 的 6.0 - 7.7 次方個。

　　分離大腸桿菌均顯示定型的生化學性狀。血清型均屬 O149 型，並均具有附著因子。

　　PRC 檢查結果確認具有 LT 及 ST 產生性遺傳基因。毒素產生能檢查結果，與 PCR 檢查結果相同。

　　分離得的毒素原性大腸桿菌對於供試 11 種藥物，僅對 Oxolinic acid，Phosphomycin 及 Gentamycin 具有感受性，對其他 8 種藥物則具有抗藥性 ( 表 2 )。

NO.1

NO.2

NO.3

空腸

回腸

結腸

肝臟

腎臟

脾臟

心臟

肺

腦

8.6

．

–

7.7

．

+++

．

8.7

．

–

．

6.0

．

+++

–

4.4

–

6.6

6.0

6.6

–

　　　　　　　　　 +++：菌落發現 31 - 100 個，數值為常用對數值

　　　　　　　　　　–：抗藥性　　　　　　　　+：相對抗藥性

　　　　　　　　　　++：相對感受性　　　　　+++：強感受性

　　3 病例共同的病變為腦髓膜下血管之水腫變性與輕度出血，實質部有神經膠質細胞的聚集與粗鬆化及出血。空腸及迴腸粘膜上皮之壞死，脫落，固有層之充血及出血格欄氏染色切片，粘膜上皮有格蘭氏陰性桿菌附著，固有層則有格蘭氏陽性桿菌存在。以大腸桿菌 O149 家兔抗血清實施的酵素抗體法染色結果，粘膜上皮出現顯示對 ELISA 呈現陽性反應的抗原物質。

　　現場檢查時發生下痢的小豬 4 頭及母豬之細菌培養檢查結果，每公克糞便中分離到 β 溶血性大腸桿菌 10 的 4.5 - 7.8 次方個。但沒有分離到芽胞梭菌。

　　細菌感染引起的哺乳豬之下痢，大部份是由大腸桿菌或芽胞梭菌引起。從發生下痢病豬分離的大腸桿菌，其血清型以 O149、O141、O8 為最多。其中血清型 O149 為具有 k88 附著因子，而一般認為是豬腸道的病原株。本報告中所分離到的 β 溶血性大腸桿菌，血清型屬於 O149，並具有附著因子 K88。下痢原性大腸桿菌之病原因子，除了附著因子外，尚有腸毒素。本報告中所分離到的菌株，均能產生 LT 與 ST。

　　芽胞梭菌在哺乳豬的感染例，大部份是毒素型 C 引起。芽胞梭菌 C 型菌之感染，發病極早，生後不久即會發生。而且大都是 C 型菌單獨發生，經過極為急性及死亡率有極高的傾向。反之，A 型菌感染之發病日齡較大，主要發生於肥育期至成豬期。A 型菌被認為是引起非傳染性壞死性腸炎的細菌。雞的壞死性腸炎大都由 A 型菌引起，其發病需要適於芽胞梭菌發育之環境，例如球蟲之感染或飼料之變化等。Amtsberg 亦曾報告，芽胞梭菌 A 菌單獨感染時不會引犢之腸毒素血症，但與大腸桿菌 O78 合併感染時，則可引起腸毒素血症。芽胞梭菌在豬之感染，C 型菌經口感染後，會附著小腸絨毛而侵入粘膜下層，引起壞死性腸炎。A 型菌則雖已明瞭 α 毒素在形成病變上佔有非常重要的角色，但經口感染後並不附著於小腸絨毛，形成壞死性腸炎之病變過程，尚未明瞭，仍待將來進一步研究解明。

　　芽胞梭菌與毒素原性大腸桿菌感染之組織病理學變化之比較，前者之特徵為粘膜組織之壞死及出血，後者則不發生壞死而僅有粘膜固有層之水腫。本病例 (1) 在組織病理學上酷似芽胞梭菌引起的壞死性腸炎，(2)在粘膜上皮表面呈現 O149 之陽性抗原，(3)從發病養豬場的發病豬及母豬之糞便中分離到毒素原性大腸桿菌，(4)分離得的芽胞梭菌非屬強毒株，故可能先由毒素原性大腸桿菌造成腸道的損傷，然後由芽胞梭菌增殖形成壞死性腸炎之形態。

　　本報告中對於所分離得之大腸桿菌之腸毒素產生能之檢查除了傳統的方法外，尚使用 PCR 法。PCR 法以 LT、ST、InvE、VT 等混合 Primer 法實施，故不僅可檢測出毒素原性大腸桿菌，尚可檢測組織侵入性，腸道出血性大腸桿菌。本報告所使用的 LT 之 Primer 可同步檢測 LTh、LTp、ST 之 Primer 亦可同時檢測 STm 及 STp。又本報告中所使用的 VT 之 Primer，經渡邊與工藤等以培養細胞法與毒素檢出比較結果，VT1、VT2、VT2ha、VT2hb、VT2vp 均與培養細胞之結果相同。PCR 法能夠在比較短時間內實施，並可同步檢測組織侵入性及其他複數毒素之產生性，故可認為是省時省力而有效的方法。

　　依據家畜衛生技術指導事業之報告，1992 年日本發生豬感染性下痢頭數約 1,600 頭，死廢率約 45%。其中早發性大腸桿菌症達約 67%，壞死性腸炎約 10%。但在美國之報告，哺乳豬 247 頭實施病原檢查結果，單獨感染大腸桿菌的佔 15%，單獨感染芽胞梭菌的佔 7.3%，大腸桿菌與芽胞梭菌混合感染的佔 8.9%，與 1988 年之報告比較，混合感染病例有增加的趨勢。

　　本主報告中所報導的混合感染病例，希望能夠引起大家的注意。

　　本報告之完成，獲得農林水產省家畜衛生試驗場九州支場中澤宗千生先生，同東北支場濱岡隆文先生及播谷亮先生等之指導及協助，謹申謝意。