免疫學在黴菌病症上的應用

梁仁忠

　　免疫學在細菌性或病毒性疾病的應用已廣為人知，譬如：疫苗的接種、抗毒血清的使用或者單簇群抗體在疾病診斷上的應用……等等，在在都和我們的生活息息相關。至於免疫學在黴菌病症上的應用則較少為人們提及，其原因不外乎黴菌引起的病症，一般來講較個別化，所造成的損失也不像細菌性或病毒性疾病那麼的急劇猛烈，因此之故，免疫學在黴菌病症上的應用，不似在細菌性或病毒性疾病上的應用，那麼普遍及廣泛。

一、前　言

　　免疫學在黴菌病症上的應用一般來講較具各別性，其發展大都是根據特殊目地而設計，茲例舉三項應用項目，以說明其使用及製備方法，希望能夠增進吾人對這些方法的了解，並從而應用之。

　　(1)免疫治療 ( immunotherapy )

　　(2)免疫擴散試驗 ( immunodiffusion  test )

　　(3)免疫組織化學診斷法 ( immunohistocheimical  methods  for   diagnosis )

二、抗原的製備

　　以上三種方法，不論是那一種方法，首先要做的就是抗原的製備。抗原的製備第一步，先要收集培養大量的菌原，各種不同的黴菌，其生長環境可能有不同的需求，無法在此一一例舉，僅以絲黴菌 ( Pythium  spp. ) 為例加以說明：

　絲黴菌是一種水生真菌，生長在高溫多濕的熱帶或亞熱帶地區，絲黴菌症的發生一般都在夏天或晚秋，最常引起馬或狗胸部、腹部及肢端的皮膚病變，偶爾也會在腸道引起慢性的嗜伊紅球性腸炎。絲黴菌可在 Sabouraud's  dextrose  agar ( SDA ) 或 vegetable  extract  agar ( VEA ) 上生長，首先將一小塊病材用蒸餾水反覆沖洗，直至沖洗液清澈為止，而後將病材浸泡在含有 250 mg  ampicillin 的 10㏄蒸餾水中 15 分鐘，處理過的病材即可置入 ager 中在攝氏 37 度下好氣培養。經由初代培養後，選取含有絲黴菌菌絲的 agar  1mm 見方，用乾淨的外科手術切開取出並切碎，重植於 SDA 或 VEA 中培養最少三天。培養後的 agar 切出的 20 塊 1mm 見方，置於 2 公升的燒杯中，並加入 400㏄經滅菌的營養液 ( nutrient  broth )，37 度下培養 10 ~ 20，直到菌絲在液面上結成片狀為止，而後將培養液倒掉，用 100㏄的滅菌生理食鹽水將菌絲塊沖洗三次，移出菌塊至另一個乾淨的大小適中的燒杯中，每個菌塊加入 15㏄ 的生理食鹽水，在無菌狀態下用超音波粉碎機打成均質，每 1㏄ 裝入一個秤過重量的乾淨瓶子中，置入攝氏 80 度的恆溫箱中過夜乾燥，定用減法計算瓶中固形物的重量，加入生理食鹽水，使其濃度成為 5 mg／ml 生理食鹽水，並調整其鹽度，使成為等張溶液 ( 0.9mg  NaCl／ml ) 抗原懸浮液製成後，再加入苯酚 ( phenol ) 使其最後濃度為 0.5%即大功告成。菌苗可儲存在攝氏 4 度的泳箱中二個月，其純度可借接種至 SDA 或 sheep  blood  agar ( SBA ) 中，攝氏 37 度培養 24 小時判定之。

三、免疫治療 ( immunotherapy )

　　在動物黴菌病症的治療上，不論是皮膚或是全身性的感染，歐美等先進國家經常使用外科切除的方法，其次是外部患處抗黴菌藥劑的塗抹或是全身性經口或注射的藥物給與，外科切除手術是一種很有效又省時省工的方法，但對動物造成的緊迫較大；藥物給與雖亦有效，但費時費工，有時藥物毒性較大，一個不小心反而造成中毒，因此，一種既安全又方便有效的治療方法就在專家學者的努力下誕生，此方法就是免疫治療法。

　　利用免疫治療法治療黴菌疾病，其菌原的使用有專一性，不同屬的菌種不互相反應，因此，臨床上必須先確定病原菌的種類，對症下〝菌〞方才有效。實行的方法非常簡單，只要將上述方法製備的菌苗 2㏄ 每禮拜皮下注射一次，連續三次即有 80%的治療效果，接種部位的皮膚會有中到強度的反應，皮膚會有紅腫痛的現象，因此，不可在同一部位連續注射。目前這種方法的應用只在皮膚病上，全身感染的應用，筆者沒有找到相關資料，但值得一試。

四、免疫組織化學診斷法 ( immunohistochemical  methods  for   diagnosis )

　　黴菌病症的初步診斷，一般是借助於肉眼及組織病理切片的觀察，但是由於不同菌種間的類似性，病因的確診必須靠菌原的培養才能確定，菌原的培養與鑑別需要一定的技術，況且有些時候病材已被丟棄，病原的培養根本不可能，因此，免疫組織化學診斷法被發展出來。這種方法可應用在組織切片上，就如同特殊染色一般，而且其特異性高，不同的菌種間不互相反應，因此，是一種非常好的診斷方法。

　　要做免疫組織化學診斷法，首先要準備抗體，2㏄ 的菌苗每周一次連續三次，打入成熟紐西蘭白兔的血管中，在第三次接種的二天後即可從耳部血管採血，靜置凝固後分離出血清，血清可冷凍保存。

　　病理組織切片的製作遵循一般原則，用 10% 的福馬林液固定，石蠟包埋，病材切成 4 um 的薄片，以二甲苯去石蠟後，覆以稀釋 10 倍的正常馬血清 20 分鐘，以阻斷非常特異的抗體結合反應，馬血清的稀釋以 0.05 M 的 PBS 行之，pH 值調至 7.2 到 7.4 之間。兔血清一樣用 PBS 稀釋十倍，和組織作用一小時後以 PBS 潤洗，而後和稀釋十倍的牛抗兔 IgG 過氧化脢作用 20 分鐘，再以 pH 5.2 的醋酸納緩衝液潤洗，其後覆以色原質溶液 ( 3–Amino–9–ethylcarbazol ) 40 分鐘，水洗後以 Mayer's  hematoxylin 複染即成。染成的組織可清楚的顯現出菌絲。

五、免疫擴散試驗 ( immunodiffusion  test )

　　活體的診斷也可藉血清學的方法做免疫擴散試驗確診，Mendoza 等在 1986 年比較三種絲黴菌抗原在雙向免疫擴散試驗的效果，結果發現以培養液過瀘後所得的抗原 ( culture  filtrate  antigen ) 其效果最佳，保存期限最長最穩定，在雙向免疫擴散試驗中可得到 4 ~ 6 條的沉澱線。抗原製備的方法是將培養絲黴菌二星期左右的培養液，經過 0.002% 的 merthiolate 滅菌，過瀘濃縮 20 倍後使用，培養皿 Agar 的洞直徑 4 mm 間隔 4 mm，分別加入抗原和血清後，高溼度室溫下反應 24 小時即可判讀。

六、參考文獻 ( 略 )

中國畜牧雜誌第五十三冊合訂本

1995年一月號至1995年六月號

第 27 卷 (95) 第 6 期 ( 29 ~ 32 )